CRISPR) je tehnika urejanja genoma tretje generacije: CRISPR je revolucioniral svet

Kratke palindromske ponovitve v gručah (CRISPR) so tehnika urejanja genoma tretje generacije, ki je s svojimi visokozmogljivimi rezultati revolucionarno spremenila svet. Uporablja se za zdravljenje različnih bioloških bolezni in okužb. Različne bakterije in drugi prokarioti (kot so arheje) imajo prav tako sisteme CRISPR/Cas9 za obrambo pred fagi. Poročali so, da lahko strategije, ki temeljijo na CRISPR/Cas9, zavirajo rast in napredovanje trojno negativnega raka dojke (TNBC) s ciljanjem na potencialno spremenjene gene odpornosti, transkripcijo in epigenetsko regulacijo. Ti terapevtski posegi lahko pomagajo pri reševanju zahtevnih težav, kot je odpornost na zdravila, ki jo opazimo celo pri TNBC. Trenutno se za dostavo CRISPR/Cas9 v ciljne celice uporabljajo različne metode, kot so fizikalne (mikroinjekcija, elektroporacija in hidrodinamični načini), virusne (adeno-povezani virus in lentivirus) in nevirusne (liposomi in lipidni nanodelci). Čeprav so bili razviti različni modeli za preučevanje molekularnih vzrokov TNBC, pomanjkanje občutljivih in ciljno usmerjenih metod za zagotavljanje orodij za urejanje genoma in vivo omejuje njihovo klinično uporabo. Skratka, ta pregled celovito preučuje napredek, izzive, omejitve in možnosti zdravljenja TNBC s CRISPR/Cas9 na podlagi obstoječih dokazov. Poudarjamo tudi, kako lahko kombinacija umetne inteligence in strojnega učenja izboljša strategije CRISPR/Cas9 pri zdravljenju TNBC.
Za raka so značilne nenadzorovana delitev celic, motnje v kontrolnih točkah celičnega cikla in mutacije v tumor supresorskih genih (TSG) (Matthews et al., 2022). Med različnimi vrstami raka je rak dojke najpogostejša vrsta raka pri ženskah in ima visoko stopnjo umrljivosti po vsem svetu (Waks in Winer, 2019). Rak dojke je heterogena bolezen z različnimi značilnostmi, kot so histološke in biološke značilnosti, klinična slika in vedenje ter odziv na zdravljenje (Weigelt et al., 2010). Klasifikacija raka dojke zagotavlja natančen vpogled v diagnozo raka dojke in prognozo tumorja. Uporaba skupnih biomarkerjev in kliničnopatoloških značilnosti je bila glavno merilo za klasifikacijo raka dojke (Tsang in Tse, 2019). Na prognozo in odziv na zdravljenje raka dojke vplivajo številni dejavniki, vključno s prisotnostjo estrogenskega receptorja (ER), progesteronskega receptorja (PR), receptorja 2 za humani epidermalni rastni faktor (HER2/neu) ter histološke stopnje, vrste in stopnje tumorja, velikosti in metastaz v bezgavkah (Al-Tubaiti, 2020). Identificiranih je bilo pet intrinzičnih molekularnih podtipov raka dojke, vključno z luminalnim A, luminalnim B, obogatenim s HER2, bazalnemu raku dojke in raku z nizko vsebnostjo klavidina (Prat et al., 2015). TNBC je molekularni podtip raka, ki ne izraža vseh ER, PR in HER2 (Yin et al., 2020). Te patološke značilnosti so povezane s TNBC, kar potrjuje njegovo hitro napredovanje in agresivnejšo naravo kot katera koli druga vrsta raka dojke (Feng et al., 2018). Poleg tega so Peru et al. (2000) uporabili tehnologijo mikromrež za prerazvrstitev raka dojke in identifikacijo petih intrinzičnih podtipov raka dojke (Cadenas, 2012). Bazalnemu raku dojke je podtip raka dojke, ki ima trojno negativni fenotip in je povezan s hitrim napredovanjem. Treba je opozoriti, da so vsi bazalnemu raku dojke pogosto napačno diagnosticirani kot TNBC, vendar je le 77 % TNBC; Nasprotno pa je 71–91 % TNBC podobnih bazalnemu raku dojke, kar kaže na to, da se ti dve vrsti raka dojke prekrivata in predstavljata različni klasifikaciji (Wang D.-Y. et al., 2019). To ustvarja potrebo po karakterizaciji heterogenosti TNBC, da bi razjasnili prognozo in opredelili možne odzive na trenutna in prihodnja zdravljenja. Poleg tega TNBC predstavlja 15–20 % vseh primerov raka dojke in je pogostejši pri ženskah, mlajših od 50 let. Mutacije BRCA1 ali BRCA2 so bile opisane v približno 20 % primerov TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Študije so tudi pokazale, da ima TNBC izrazito imunsko mikrookolje, ki vključuje visoke ravni rastnih faktorjev žilnega endotelija, makrofagov, povezanih s tumorjem (TAM), limfocitov, ki infiltrirajo tumor (TIL), in drugih molekul, ki sodelujejo pri rasti in migraciji tumorja. Zato je razumevanje mikrookolja TNBC ključnega pomena za njegovo prognozo in zdravljenje (Fan in He, 2022).
Za oceno prognoze TNBC in zagotovitev učinkovitega zdravljenja je pomembna natančna diagnoza, ki temelji predvsem na imunohistokemiji (IHC) za odkrivanje ER, PR in HER2 ter mamografiji za odkrivanje neoplazem dojk. Vendar pa mamografija ne more ustrezno prikazati intratumorskih značilnosti, kot sta nekroza in fibroza (Deepak Singh et al., 2021). Ker slaba prognoza in diagnoza zdravnikom preprečujeta predpisovanje pravih zdravil (Chaudhary, 2020), se za izboljšanje oskrbe bolnikov s TNBC uporabljajo različne strategije. Trenutno se pri bolnikih s TNBC uporabljata dve zdravili, doksorubicin in ciklofosfamid, ki sta pokazali dobre rezultate. Poleg tega se uporabljajo tudi druga zdravila na osnovi platine, kot sta karboplatin in cisplatin (Sikov et al., 2015). Poleg tega se kot potencialna kemoterapevtska zdravila za zdravljenje TNBC uporabljajo zaviralci PARP, kot so Olaparib, Velaparib in PF-01367338 (Ishino et al., 2018). Ker je bilo ugotovljeno, da so signalne poti Wnt/b-katenina, NOTCH in Hedgehog vključene v nastanek in napredovanje TNBC, je lahko ciljno usmerjanje zdravil na te poti pomembna strategija (Aysola et al., 2013). Čeprav kirurgija, radioterapija in kemoterapija ostajajo glavna opora zdravljenja TNBC danes, je bil dosežen pomemben napredek pri razvoju novih zdravljenj, vključno s ciljno terapijo, imunoterapijo, različnimi orodji za urejanje genov, povezanimi s CRISPR, kot so Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, primarno urejanje in genska terapija, usmerjena v CRISPR/Cas9. Tukaj se bomo osredotočili na različna orodja za urejanje genov, povezana s CRISPR, ki se uporabljajo pri zdravljenju TNBC. Med njimi je CRISPR/Cas9 deležen široke pozornosti.
Cas9n, znan tudi kot Cas9 nikaza, je gensko spremenjena različica proteina Cas9, ki izhaja iz sistema za urejanje genoma CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). V svoji prvotni obliki protein Cas9 vsebuje dve nukleazni domeni: RuvC in HNH, katerih glavna funkcija je cepitev obeh verig DNK. Vendar pa je v Cas9n ena od nukleaznih domen, HNH, gensko mutira in postane neaktivna. Zato domena HNH v Cas9n ostane nefunkcionalna. Aktivna ostane le domena RuvC, kar Cas9n omogoča, da reže ali ustvarja prelome na posameznih verigah DNK (Trevino in Zhang, 2014). V primerjavi s Cas9 lahko Cas9n učinkovito zmanjša učinke izven tarče in natančno izboljša mehanizme popravljanja celic. Cas9n se lahko uporablja za reševanje različnih problemov, kot je ustvarjanje prelomov na določenih mestih v dvoverižni DNK. V ta namen sta bili dve molekuli Cas9n združeni in uporabljeni skupaj (Yee, 2016). Mešana linijska kinaza 3 (MLK3) je mitogenom aktivirana proteinska kinaza, ki služi kot ključni regulator med metastazami TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 lahko aktivira več signalnih poti, ki vodijo do metastaz TNBC. Na primer, pot c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) uravnava gibljivost celic in razgradnjo zunajceličnega matriksa, MLK3 pa aktivira pot JNK, s čimer poveča gibljivost celic in jim podeli invazivne lastnosti (Rattanasinchai in Gallo, 2016). MLK3 uravnava tudi EMT. Da bi to dosegel, aktivira transkripcijske faktorje, kot so Snail, Slug in Twist. Ti dejavniki zavirajo izražanje epitelijskih markerjev in spodbujajo izražanje mezenhimskih markerjev, kar vodi do pridobitve metastatskega fenotipa (Casalino et al., 2023). Opazili so, da ima MLK3 vlogo pri preoblikovanju zunajceličnega matriksa (ECM) in aktivaciji proteaz, kot so matrične metaloproteinaze (MMP), ki razgrajujejo zunajcelični matriks (ECM). To olajša invazijo tumorskih celic in njihovo širjenje na oddaljena mesta (Katari et al., 2019). Tako so prejšnje študije pokazale, da ima MLK3 ključno vlogo pri TNBC. Rattanasinchai in Gallo sta uporabila modele TNBC za preučevanje vloge MLK3 in ugotovila, da ta spodbuja razvoj raka prek specifičnih signalnih poti. Za urejanje MLK3 sta uporabila CRISPR/Cas9n in opazila znatno zmanjšanje metastaz TNBC (Rattanasinchai in Gallo, 2016).
dCas9, pogosto imenovan neaktivni Cas9, je modificirana derivatna oblika proteina Cas9. Za razliko od aktivnega Cas9 dCas9 nima endonukleazne aktivnosti, zaradi česar ne more povzročiti dvojnih prelomov verige DNK. Zato se lahko dCas9 uporablja za natančno ciljanje specifičnih regij genoma brez kakršnih koli sprememb ali modifikacij zaporedja DNK (Wang et al., 2016). V dCas9 sta dva endonukleazna proteina, RuvC in HNH, inaktivirana z zaviranjem pomembnih aminokislinskih ostankov. (Richter et al., 2016). Kljub pomanjkanju aktivnosti cepitve DNK ima dCas9 številne pomembne vloge v genetskih raziskavah in biotehnologiji. Na primer, omogoča vizualizacijo specifičnih regij genoma, olajša transkripcijsko regulacijo in spodbuja epigenetske modifikacije (Brocken et al., 2018).
Transkripcijski faktor ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) ima specifično in ključno vlogo pri posredovanju epitelijsko-mezenhimskega prehoda (EMT), celičnega procesa, ki se pojavi med embrionalnim razvojem, popravilom tkiva in napredovanjem raka. Vključuje transformacijo epitelijskih celic v mezenhimske celice, kar povzroči spremembe v celični morfologiji, gibljivosti, invazivnosti itd. (Wu et al., 2020). ZEB1 zavira več epitelijskih markerjev, kot sta E-kadherin in okludin, ki sta odgovorna za vzdrževanje medcelične adhezije in polarnosti epitelijskih celic pri TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Poleg tega ZEB1 aktivira določene markerje, kot so N-kadherin, vimentin in fibronektin (Konradi et al., 2014), in uravnava tudi gene, ki sodelujejo pri preoblikovanju citoskeleta, kot so Rho GTPaze in matrične metaloproteinaze (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), poleg tega pa vpliva tudi na različne signalne poti, kot so transformirajoči rastni faktor-β (TGF-β), Wnt signalizacija itd., s čimer spodbuja invazijo tumorja in metastaze pri TNBC (Chen et al., 2016). Številne študije in znanstveni dokazi kažejo, da ima ZEB1 velik potencial kot dragoceno sredstvo za odkrivanje in terapevtsko intervencijo TNBC. V nedavni študiji so Waryah et al. uporabili model TNBC in dosegli popolno zaviranje ZEB1 z dCas9. Tako so opazili zelo visoko specifičnost in skoraj popolno zaviranje ZEB1 v pogojih in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 je orodje za urejanje genov, imenovano CRISPR/Cpf1. Izhaja iz sistema CRISPR/Cas, kjer se izraz Cas12 nanaša na protein 12, povezan s CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), ki je popolnoma podoben Cas9. Edina razlika je, da vsebuje protein Cas12. V primerjavi s Cas9 ima Cas12 nekaj edinstvenih funkcij, kot je ustvarjanje lepljivih koncev med procesom urejanja genov, medtem ko Cas9 ustvarja tope konce (Wang et al., 2021). Ta lastnost Cas12 prispeva k njegovi specifični tehnologiji manipulacije DNK. Kot protein, ki je sposoben natančnega prepoznavanja in rezanja ciljne DNK, ima izjemno vsestranskost, zaradi česar je učinkovito orodje za različne aplikacije, vključno z urejanjem genov (Pickar-Oliver in Gersbach, 2019).
Podobno kot druge različice CRISPR je tudi CRISPR/Cas12 sposoben izbiti ali aktivirati gene v TNBC, pri čemer cilja na gene, ki igrajo pomembno vlogo pri njegovi patogenezi ali odzivu na zdravljenje (Yang in Zhang, 2023). Za dosego tega procesa je bila razvita vodilna RNA (gRNA), ki usmerja Cas12 na ciljni gen. Ko se Cas12 veže na svoj cilj, v DNK vnese dvojne prelome in aktivira mehanizme popravljanja DNK. Med procesom popravljanja se lahko vključijo napačni nukleotidi, kar vodi do genskih mutacij in izgube funkcije (Zhang et al., 2021a). Poleg tega je bila za aktivacijo genov uporabljena tudi izboljšana različica encima Cas12 (imenovana dCas12). Z združitvijo z aktivatorjem transkripcije je mogoče inducirati določene gene in jih s tem aktivirati. Ta tehnologija ima velik potencial pri spodbujanju aktivacije genov, ki zavirajo tumorje (Sultan et al., 2022).
Primarno urejanje je novo razvita in izjemno napredna tehnologija urejanja genoma. Sposobna je zelo natančno spreminjati DNK organizma (Chen in Liu, 2023). Primarno urejanje se doseže z integracijo dveh glavnih komponent: modificiranega encima CRISPR/Cas9 in reverzne transkriptaze. Vloga encima CRISPR/Cas9 je selektivno ciljanje na natančna mesta v genomu, medtem ko reverzna transkriptaza pomaga temeljito spremeniti DNK na ciljnem mestu (Hassan et al., 2021). Pri mehanizmu urejanja primerjev prvi korak vključuje ustvarjanje vodilne RNA za urejanje primerjev (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Vsebuje ciljno zaporedje in predlogo RNA, ki ustreza želenemu mestu urejanja v ciljni DNK. PegRNA se nato vnese v ciljne celice skupaj z nukleazo za urejanje primerjev (PE2). PE2 je fuzijski protein, ki ga sestavljajo encim Cas9, reverzna transkriptaza in adapter za urejanje primerjev (Martín-Alonso et al., 2021). Znotraj celice kompleksa pegRNA in PE2 iščeta specifično DNK, ki jo želita modificirati. Encim Cas9 reže DNK in ustvari predlogo, ki jo sestavljajo posamezne verige (Choi et al., 2022). Reverzna transkriptaza uporablja to predlogo za pripravo DNK za urejanje. Poleg kopiranja DNK so vključena tudi navodila za urejanje predloge RNA. Nazadnje se novo ustvarjena veriga DNK uporabi kot predloga za popravilo preloma v DNK, kar ima za posledico spremenjeno zaporedje DNK, ki vsebuje želeno modifikacijo (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Mehanizmi urejanja začetnih oligonukleotidov lahko vodijo do razširjenih mutacij v genih. Lahko ciljajo na točkovne mutacije, insercije, delecije in celo zamenjave genov (Anzalone et al., 2019; Chen in Liu, 2023). Urejanje začetnih oligonukleotidov ponuja več prednosti pred prejšnjimi tehnologijami urejanja genoma. Te vključujejo večjo natančnost, zmanjšane učinke zunaj tarče in možnost urejanja DNK brez zanašanja na dvoverižne prelome DNK (Anzalone et al., 2020).
Tehnologija CRISPR/Cas9 je bila prvotno razvita za zaščito bakterij pred prenosom plazmidov in okužbo s fagi, kasneje pa je bila ponovno uporabljena kot učinkovito orodje za ciljanje DNK na osnovi RNA za urejanje genoma (Jiang in Doudna, 2017). Poleg tega je bilo poročano, da je sistem CRISPR/Cas9 prisoten v 50 % oziroma 87 % bakterijskih in arhejskih genomov (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 je potencialno orodje za brisanje, vstavljanje in popravljanje katerega koli nenormalnega genetskega zaporedja z uporabo in vivo in in vitro načinov (Sabit et al., 2021). Poleg tega se je izkazalo, da je CRISPR/Cas9 del adaptivnega imunskega sistema zaradi svoje specifičnosti za ciljne gene, ki nas zanimajo (Chen in Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 je sestavljen iz Cas9 in ene same vodilne RNA (sgRNA). Cas9 je endonukleaza, sestavljena iz več beljakovinskih komponent. Poleg tega ima Cas9 edinstvene strukturne in konformacijske lastnosti (Pacesa et al., 2022), saj je sestavljen iz dveh rež: prepoznavnega (REC) in nukleaznega (NUC). Reženj REC je nadalje razdeljen na tri regije: REC1, REC2 in mostne vijačnice (Cromwell et al., 2018). NUC je sestavljen iz treh rež, in sicer RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH in interakcijske domene s protospacerskim sosednjim motivom (PAM) (slika 1) (Song et al., 2016). sgRNA je sestavljena iz dveh komponent, vključno s CRISPR RNA (crRNA) in transkodirajočo majhno RNA (sledilna RNA) (slika 1). SgRNA povezuje protein Cas9 s koneksini in tvori aktivni kompleks, znan tudi kot efektorski kompleks (Richter et al., 2012). crRNA je bazni par z 18–20 nukleotidi, ki igra ključno vlogo pri prepoznavanju ciljnih zaporedij DNK. Poleg tega se crRNA veže s ciljno DNK, tracrRNA pa deluje kot ogrodje, na katerega se nukleaza Cas9 veže na ciljno DNK (Manghwar et al., 2019). Po drugi strani pa ima zaporedje PAM 3 nukleotide, kar potrjuje, določa in posreduje pri vezavi efektorske kompleksa na DNK. Podenoti RuvC in HNH proteinskega kompleksa Cas9 imata katalitično aktivnost (Richter et al., 2012; Asmamaw in Zawdie, 2021). Nukleazna domena HNH podenote Cas9 cepi verigo DNK, povezano s crRNA. Nukleazna domena RuvC cepi druge verige DNK in ustvarja dvoverižne prelome (DSB), nakar se aktivirata dva različna mehanizma za popravljanje prelomov DNK (Jiang in Doudna, 2017) (slika 1).
Slika 1. Pregled CRISPR/Cas9 (A). Komponente sistema CRISPR/Cas9: (i). Endonukleaza Cas9 je odgovorna za rezanje ciljnega zaporedja DNK, (ii) enojna vodilna (sg) RNK, ki nastane z zlitjem himer crRNA in tra-crRNA. (dve). Cas9 vključuje več komponent, kot so Rec I, Rec II, NUC lobe (HNH in Ruv C sta podkomponenti) in interakcijska domena PAM (C) z ustreznimi funkcijami. Beljakovinski kompleks CRISPR/Cas9 cepi zaporedja DNK v nekomplementarne in komplementarne oblike (D). CRISPR/Cas9 ureja genom v treh fazah: prepoznavanje, rezanje in popravilo. Zasnovana sg-RNK vodi Cas9 in prepozna želeno zaporedje prek komplementarne komponente crRNA. Cas9 prepozna zaporedje PAM na 5′-NGG-3′ in stopi DNK, pri čemer tvori hibrid DNK-RNK in aktivira cepitev. Domena HNH gena Cas9 cepi komplementarno verigo, domena RuvC pa nekomplementarno verigo. CRISPR/Cas9 popravlja dvoverižno DNK tako, da jo prekine na dva načina: z nehomolognim spajanjem koncev (NHEJ) in s homologno usmerjenim popravilom (HDR). NHEJ popravlja dvoverižno DNK v odsotnosti tuje homologne DNK z encimskim procesom, mehanizmom, ki je nagnjen k napakam in lahko vstavi ali odstrani naključna zaporedja DNK. HDR je zelo specifičen in zahteva homologne predloge DNK.
Popravilne poti, posredovane s CRISPR/Cas9, vključujejo mehanizme nehomolognega spajanja koncev (NHEJ) in homologno usmerjenega popravljanja (HDR). NHEJ je pot, nagnjena k napakam, ker vključuje vstavljanje ali brisanje in med mehanizmom popravljanja ne zahteva nobenega vzorca. Za ustvarjanje standardnih beljakovin uporablja naključne nukleotide (Abbasi et al., 2021). Ta sistem popravljanja je sestavljen iz štirih kompleksov, kot so kompleks KU, navzkrižno komplementarni proteinski kompleks tipa 4 (XRCC-4), encim za obdelavo koncev DNK in proteinska kinaza DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Kompleksni protein KU ima dve podenoti, Ku 70 in Ku 80, in igra pomembno vlogo v mehanizmu NHEJ, saj se mehanizem popravljanja sproži z vezavo dveh podenot (Ku 70 in Ku 80) na tope ali skoraj tope konce ciljne DNK (Abbasi et al., 2021), ki služita kot oder za rekrutiranje drugih faktorjev, povezanih z NHEJ, na mesto poškodbe (Yang et al., 2020). XRCC-4 in DNA ligaza sta sestavljena iz 334 oziroma 911 aminokislin, kompleks XRCC4-DNA ligaza IV pa spodbuja ligacijo koncev DNK (Chatterjee et al., 2015). Encim za obdelavo koncev DNK, znan tudi kot polinukleotidna kinaza 3'-fosfat, je encim za obdelavo koncev DNK. Med popravilom DSB lahko odstrani skupino 3'P v DNK in fosforilira skupino 5'OH. Vključuje tudi popravilo enoverižnih prelomov (SSB) z uporabo poti popravljanja SSB (Chatterjee et al., 2015). Proteinska kinaza DNA-PKcs je od DNA odvisna proteinska kinaza, ki jo sestavlja katalitična podenota družine PIKK (kinaze, povezane s fosfatidilinozitolom 3-kinazo) in ataksija telangiektazija mutiranih (ATM), pa tudi ATR, povezani z ATM in Rad3, prelomi verig (DSB) in enoverižni prelomi (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR je natančnejši in primernejši mehanizem popravljanja, ker se informacije kopirajo z uporabo nedotaknjene oblike homolognega dupleksa DNK, čeprav zahteva prisotnost sestrskih kromatid. To se zgodi med fazo S/G2 sesalskega celičnega cikla. HDR se pojavlja predvsem pri kvasovkah, NHEJ pa je ključnega pomena pri sesalcih (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Celoten mehanizem popravljanja je prikazan na sliki 1.
Ker TNBC povzročajo genetske in epigenetske nepravilnosti, je lahko korekcija malignih genomskih/epigenomskih nepravilnosti z uporabo CRISPR/Cas9 razumen terapevtski pristop (Chen et al., 2019). Poleg tega lahko nekateri transkripcijski faktorji, ki sodelujejo pri celično specifični transkripcijski regulaciji, kažejo edinstvene značilnosti rakavih celic, kar kaže na to, da je transkripcijska regulacija lahko odličen pristop za zdravljenje raka (Drost et al., 2017). Izkoriščanje teh molekularnih značilnosti tumorjev, kot so genetske, epigenetske in transkripcijske napake, za razvoj zdravil lahko izboljša klinične izide in zmanjša stroške presejanja. CRISPR je potencialno orodje za urejanje genov, ki ne le zazna in identificira genomske tarče, ki povzročajo raka, temveč se lahko uporablja tudi za urejanje, zaviranje in epigenetsko spreminjanje onkogenov v človeških celicah (tabela 1) (Ahmed et al., 2021). Izvedenih je bilo več presejalnih testov CRISPR za iskanje genov, povezanih s tumorskimi supresorji, onkogeni in odpornostjo na zdravila. Uporaba CRISPR/Cas9 za urejanje različnih onkogenov TNBC je prikazana na sliki 2.
Slika 2. Urejanje genov različnih onkogenov TNBC z uporabo CRISPR/Cas9, ki ima za posledico zmanjšano rast tumorja in metastaze. Ti onkogeni vključujejo CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 in CXCR7, Crypto1, ROR1 in ST8SIA, ki sodelujejo pri nastanku in metastazah TNBC.
Migracija, invazija in epitelijsko-mezenhimski prehod (EMT) rakavih celic so povezani z ITGA9. Prejšnje študije so pokazale, da je ITGA9 ključni akter v poti Notch in ima zanimivo vlogo pri metastazah rabdomiosarkoma (Molist et al., 2020). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da je ITGA9 tesno povezan s prognozo bolnikov pri več vrstah tumorjev, vključno z rakom dojke (Wang Z. et al., 2019). Poleg tega je bioinformatična analiza ITGA9 pokazala, da je bila njegova ekspresija v TNBC bistveno višja kot pri drugih podtipih raka dojke. Povišane ravni ITGA9 so povezane z metastazami tumorjev in ponovitvijo bolezni pri bolnikih s TNBC. Izločanje ITGA9 s CRISPR/Cas9 je povzročilo lastnosti, podobne rakavim matičnim celicam (CSC), tumorsko angiogenezo, rast tumorja in zmanjšanje metastaz s spodbujanjem razgradnje β-katenina v TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Kripto-1 je član družine TGF-β in je ključnega pomena za zgodnjo embriogenezo, vzdrževanje matičnih celic in metastaze raka (Ishii et al., 2021). Znan tudi kot Tdgf-1, je onkogeni signalni protein, zasidran na GPI, ki sodeluje pri regulaciji nastanka primitivne proge, mezoderma in endoderma, pa tudi pri vzpostavitvi leve/desne asimetrije pri razvoju telesnih organov med embriogenezo (Zhang et al., 2021b). Poleg tega se je pokazalo, da je Cripto-1 vključen v epitelijsko-mezenhimski prehod (EMT) kot označevalec matičnih celic (Zhang et al., 2021b). EMT je ključnega pomena ne le za različne procese, kot so embrionalni razvoj, fibroza in celjenje ran, temveč tudi za invazijo in metastaze raka. Poleg tega se je pokazalo, da Cripto-1 interagira s štirimi receptorji Notch in pospešuje njihovo posttranslacijsko zorenje (Brandstadter in Maillard, 2019). Znano je, da je signalna pot Notch vključena v vzdrževanje celic raka dojke pri ljudeh. Študije so pokazale, da s CRISPR/Cas9 posredovana izločitev kripto-1 zavira rast in metastaze raka. Zato bi lahko kripto-1 postal pomembna terapevtska tarča za TNBC (Castro et al., 2015).
Protein XCL12 in njegov kemokininski receptor CXC (CXCR4 in CXCR7) igrata različne vloge pri proliferaciji, rasti, migraciji in invaziji rakavih celic (Wu et al., 2015). Ti kemoreceptorji so bili povezani z razvojem TNBC prek več signalnih poti tako v modelih in vivo kot in vitro (Wu et al., 2015). Poleg tega je aktivacija CXCR4 in CXCR7 povezana z večjo dovzetnostjo za metastaze in slabo prognozo pri TNBC (Karn et al., 2022). Zato bi lahko izločitev CXCR4 in CXCR7 postala učinkovita ciljna gena za zdravljenje raka dojke, vključno s TNBC. Študija Yanga et al. Yang et al. (2019) je uporabil CRISPR/Cas9 za sočasno izločitev genov CXCR4 in CXCR7 ter ugotovil, da so bile proliferacija, rast, migracija in invazija TNBC znatno zavirane (Yang et al., 2019).
V tkivih raka dojke so opazili povišane ravni miR-3662, onkogena TNBC (Yi et al., 2022). Dokazano je, da zaviranje miR-3662 zavira rast in metastaze tumorja raka dojke tako in vivo kot in vitro (Agarwal in Gupta, 2021). HBP-1 je močan zaviralec signalizacije Wnt/-katenin in je verjetno odgovoren za rast celic TNBC, ki jo posreduje miR-3662. Nedavno so Yi et al. ugotovili, da os miR-3662-HBP1 uravnava signalno pot Wnt/-katenin v celicah TNBC (Yi et al., 2022). Zaradi svoje tumorsko specifične ekspresije je miR-3662 lahko potencialna terapevtska tarča za TNBC. Zato je lahko zaviranje miR-3662, ki ga posreduje CRISPR/Cas9, odličen pristop za razvoj novih zdravil za zdravljenje TNBC.
UBR5 je 300 kDa nukleofosfoprotein, ki je bil opredeljen kot ključni regulator tumorogeneze, metastaz in imunskega odziva pri različnih vrstah raka (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Poročali so, da je UBR5 v vzorcih TNBC močno povečano izražen in stimulira delovanje ERα z indukcijo proliferacije prek svoje aktivnosti ubikvitin ligaze (Bolt et al., 2015). Študije sekvenciranja celotnega eksoma primarnih vzorcev TNBC so prav tako pokazale povečano izražanje UBR5, kar kaže na njegovo vlogo pri razvoju TNBC. Poleg tega je delecija UBR5, ki jo povzroča CRISPR/Cas9, pokazala znatno zaviranje metastaz in rasti TNBC v eksperimentalnih mišjih modelih. Poleg tega je vključitev UBR5 v mišji model divjega tipa obnovila njegovo polno funkcionalnost, medtem ko ta učinek ni bil opažen pri inaktiviranih mutantnih sevih (Liao et al., 2017). Pomanjkanje UBR5 je povezano s povečano apoptozo, nekrozo in zaviranjem rasti tumorja pri TNBC zaradi slabe angiogeneze. Zaradi izgube UBR5 se zmanjša širjenje tumorja v oddaljene organe, UBR5 pa povzroča nenormalni EMT predvsem z zmanjšanjem izražanja E-kadherina (Zhang in Weinberg, 2018). Nedavno se je izkazalo, da je UBR5 zelo pomemben dejavnik pri transkripciji PDL1, ki jo inducira IFN-γ, pri TNBC zaradi pomanjkanja ubikvitinacijske aktivnosti E3. Analiza transkriptoma RNA je pokazala, da ima lahko UBR5 sistemske učinke na gene, povezane s potjo IFN-γ, in spodbuja transaktivacijo PDL1 s povečanjem ravni aktivacije proteinske kinaze RNA (PKR) in njenih signalnih pretvornikov in aktivatorjev, transkripcije 1 (STAT1) in regulatornega faktorja interferona 1 (IRF1). Vendar pa ima kombinirana ablacija izražanja UBR5 in PD-L1, ki jo posreduje CRISPR/Cas9, sinergistični terapevtski učinek kot vsaka blokada posebej, z močnimi učinki na mikrookolje tumorja (Wu et al., 2022). CRISPR/Cas9 je torej lahko pomembno orodje za zaviranje delovanja UBR5, s čimer zavira metastaze TNBC in rast tumorja.
ROR1 je transmembranski protein tipa I, ki se izraža med rakom in embrionalnim razvojem ter je bil identificiran kot onkofetalni protein (Nicholas Borcherding, 2014). Invazivno vedenje različnih vrst raka pri ljudeh je povezano s povečano ekspresijo ROR1. Obetavni rezultati so bili pridobljeni iz študij in vivo in in vitro, ki so vključevale terapevtske spojine, usmerjene proti ROR1 (Chien et al., 2016). Povišane ravni mRNA ROR1 v biopsijah tkiva dojk so bile povezane tudi z agresivnimi bazalnemu tumorjem dojk (BL) in njihovo migracijo v druge dele telesa. Poleg tega je bilo prekomerno izražanje ROR1 opredeljeno kot prognostični marker za razvoj TNBC (Chien et al., 2016). Vendar bi bila učinkovita strategija utišanje ROR1 z uporabo CRISPR/Cas9 za zaviranje rasti in metastaz TNBC.
Proces sialilacije vključuje dodajanje sialinske kisline glikokonjugatom, ki ga katalizirajo sialiltransferaze (ST). ST8SIA1 spada v družino ST in ima pomembno vlogo pri patogenezi različnih bolezni, kot sta limfocitna levkemija in kolorektalni rak (Chang et al., 2018). Analiza zaporedja RNA kaže, da je ST8SIA1 močno izražen v tkivu dojk bolnic s TNBC in je pozitivno povezan z mutacijami v genu za zaviranje tumorja p53, kar lahko prispeva k patogenezi TNBC (Battula et al., 2017). Poleg tega je ST8SIA1 vključen v metastaze in ponovitev TNBC, kar kaže na to, da igra pomembno vlogo pri nastanku in razvoju TNBC. V in vitro modelu TNBC je bilo dokazano, da zaviranje ST8SIA1 s CRIPSR/Cas9 blokira rast in metastaze (Battula et al., 2017). To kaže, da je CRISPR/Cas9 lahko pomembno orodje za zaviranje delovanja onkogena ST8SIA1 pri zdravljenju TNBC.
NAT1 je presnovni encim, ki katalizira nastanek ksenobiotičnih spojin faze II in se izraža v skoraj vseh človeških tkivih. NAT1 lahko s kofaktorjem folatom cilja na acetil-CoA (acetil-CoA) tudi v odsotnosti aromatskega aminskega substrata (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Študije so pokazale, da NAT1 uravnava delovanje matrične metaloproteinaze 9 (MMP9) v modelih celic raka dojke in ščiti pred reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS) med stradanjem zaradi glukoze (Wang et al., 2018). Dokazano je, da delecija NAT1 zavira kompleks piruvat dehidrogenaze, kar vodi do mitohondrijske disfunkcije (Wang L. et al., 2019). Poleg tega so različna druga poročila pokazala, da lahko zaviranje NAT1 z uporabo majhnih molekul in utišanja siRNA zmanjša invazivnost in proliferacijo celic raka dojke (Stepp et al., 2018). Nedavno je bil CRISPR/Cas9 uporabljen za zaviranje NAT1 v celični liniji raka dojke MDA-MB-231, kar vpliva na celični metabolizem glede na raven izražanja. Ta študija je tudi pokazala, da je NAT-1 ključnega pomena za napredovanje in metastaziranje TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koordinirano transkripcijo onkogenov regulirajo super ojačevalci, transkripcijski faktorji in kofaktorji (Hnisz et al., 2015). Poleg tega je za transkripcijsko regulacijo potrebna skupina ciklin-odvisnih kinaz (CDK), kot so CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 in CDK13. Med njimi je CDK7 vključena v fosforilacijo RNA polimeraze II, ki je zelo pomembna za začetek in širitev transkripcije onkogena pri patogenezi TNBC. V prelomni študiji je delecija CDK7 s CRISPR/Cas9 zavrla TNBC, kar kaže, da je patogeneza TNBC odvisna od CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Študije so pokazale, da lahko mutacije v MYC in RBP (RNA vezavni protein) vodijo do apoptoze, medtem ko mutacije posameznih genov v MYC ali RBP ne vplivajo na rast rakavih celic (Einstein et al., 2021). Z uporabo knjižnice, ki temelji na CRISPR/Cas9, je bilo pregledanih več kot 1000 RBP v človeškem genomu. Med njimi je bilo ugotovljeno, da je 57 RBP ključnih za rast rakavih celic z zelo povišanimi ravnmi MYC (Wheeler et al., 2020). Poleg tega je YTHDF2 pomemben za ohranjanje rasti celic TNBC in zmanjšuje količino metiliranih transkriptov med transkripcijo in translacijo na visoki ravni v rakavih celicah z višjo ekspresijo MYC. Poleg tega YTHDF2 ni bistven za rakave celice, ki so manj odvisne od povišanih ravni MYC za podaljšanje preživetja bolnikov s TNBC (Einstein et al., 2021), kar kaže na to, da bi lahko bil potencialna terapevtska tarča za zdravila, ki lahko premagajo TNBC.
Cinkovi prstni proteini (ZNF) predstavljajo približno 1 % celotnega človeškega genoma. Študije so pokazale, da lahko ZNF uravnava proliferacijo celic pri različnih vrstah raka, kot so rak jeter, rak dojke in kolorektalni rak (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Knjižnice, ustvarjene z izključitvijo CRISPR, so bile uporabljene za presejanje različnih genov za zaviranje tumorjev (TSG) v celicah raka dojke (Shalem et al., 2014). Od takrat je transkriptomska študija celic raka dojke z izbrisanim ZNF319 iz CRISPR/Cas9 pokazala, da je ZNF319 gen za zaviranje tumorjev, ki zmanjšuje proliferacijo raka dojke in je zato vključen v različne potencialne signalne mehanizme in druge biološke funkcije (Wang L. et al., 2022).
Feroptoza je vrsta programirane celične smrti, ki je odvisna od prisotnosti železa. Znano je, da na razvoj feroptoze vpliva prisotnost lipidnih peroksidov. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da PKCβII kaže zgodnjo lipidno peroksidacijo, povečana lipidna peroksidacija pa je povezana s feroptozo. Pregled knjižnice zaviralcev kinaze, posredovanih s CRISPR/Cas9, je pokazal, da je PKCβII vključen v proces lipidne peroksidacije, ki je ključnega pomena za feroptozo v celicah MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). To torej kaže, da bi lahko izločanje PKCβII s strani CRISPR/Cas9 predstavljalo potencialno tarčo tumor-supresorskega gena za zdravljenje bolezni, povezanih s feroptozo (Zhang et al., 2022).
Domneva se, da je odpornost na zdravila odgovorna za približno 90 % smrti pri bolnikih z rakom in je eden glavnih izzivov pri zdravljenju raka (Bukowski et al., 2020). Rezultati kažejo, da je z odpornostjo na zdravila povezanih zadostno število genov, povezanih z izločanjem zdravil, popravljanjem DNK, apoptozo in različnimi celičnimi signalnimi potmi (Haider et al., 2020). Med njimi je bilo več genov, ki so bili tarča orodij CRISPR/Cas9, in so pokazali obetavne rezultate pri zmanjševanju odpornosti na zdravila in povečanju učinkovitosti zdravljenja raka (Vaghari-Tabari et al., 2022). Poleg tega so bile visokozmogljive knjižnice za presejanje izločkov genov CRISPR/Cas9 vpletene v spreminjanje funkcije potencialnih tarč genov za odpornost na zdravila (Shalem et al., 2015). Za identifikacijo genov za odpornost na paklitaksel je bilo uporabljeno sekvenciranje RNA, povezano s presejanjem knjižnice sgRNA na ravni celotnega genoma, za identifikacijo osmih kandidatnih genov, vključno s histonsko deacetilazo 9 (HDAC9), ki so povezani z odpornostjo na zdravila pri bolnikih s ponavljajočim se TNBC (B et al., 2020). V drugi študiji je bilo med preživetjem bolnikov s TNBC, zdravljenih z zdravili proti raku, opaženo povečano izražanje diserina/treonina in tirozin protein kinaze (DSTYK). Poleg tega je s CRISPR/Cas9 posredovano zmanjšanje izražanja DSTYK znatno povečalo apoptozo rakavih celic, odpornih na zdravila, in vitro (celice SUM102PT in celice MDA-MB-468) ter v modelu TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Čeprav ima TNBC nenormalno aktivacijo poti MAPK, je klinični učinek terapij, usmerjenih proti MEK, slab. Pregled genomske knjižnice CRISPR/Cas9 je pokazal, da inhibicija PSMG2 (šaperon 2 za sestavljanje proteoma) senzibilizira celice TNBC BT549 in MB468 na zaviralec MEK AZD6244. Z zaviranjem PSMG2 s CRISPR/Cas9 je spremenjeno normalno delovanje proteasoma, kar je povzročilo avtofagijo posredovano razgradnjo PDPK1, s čimer se je dodatno izboljšalo stanje tumorskih celic v mišjih modelih TNBC, ki ga je povzročila AZD6244 (zaviralec MEK) in MG132 (zaviralec proteasoma). Tako se lahko zaviralci proteasoma in MAP kinaze (MEK) dajejo sinergistično za zmanjšanje proliferacije tumorskih celic (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 se uporablja tudi za presejanje izgube genske funkcije, ki vodi do odpornosti na TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. so pojasnili mehanizem odpornosti rakavih celic na zdravila, zdravljenih z JQ1, zaviralcem bromodomene BET (BBDI), pri TNBC. Z uporabo CRISPR/Cas9 so ugotovili, da je izbris gena rb1 povzročil, da je TNBC postal odporen na zdravilo proti raku JQ1. Zato je funkcija rb1 pomembna pri odzivu na zdravila JQ1 pri TNBC. Poročali so tudi, da je paklitaksel zaviralec kinaze/mikrotubulov CDK4/6 in da lahko njegova kombinacija z BBDI, kot je JQ1, zagotovi obetavne terapevtske odzive na TNBC, odporen na zdravila (Ge et al., 2020).
Poročali so, da je transkripcijska pokrajina dolge nekodirajoče RNA (lncRNA) odgovorna za odpornost na neoadjuvantno zdravljenje pri TNBC. Ta študija kaže, da je pet različnih transkriptov MALAT1 lncRNA visoko izraženih pri TNBC. Poleg tega je delecija MALAT1, posredovana s CRISPR/Cas9, povečala občutljivost celic TNBC BT-549 na paklitaksel in doksorubicin, kar kaže na možno vlogo odpornosti na MALAT1 pri TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutacije v genu BRCA1 (BRCA1m) so heterogene in jih je zato težko zaznati. Ciljanje na PARP1 (poli(ADP-riboza) polimeraza), sintetični smrtonosni partner BRCA1, lahko poveča kemosenzibilnost zdravil pri TNBC. Z uporabo CRISPR/Cas9 je delecija PARP1 povečala občutljivost zdravil proti raku, kot so doksorubicin, gemcitabin in docetaksel, na celice TNBC z mutantnim mBRCA1, kar kaže na to, da je PARP1 vključen tudi v odpornost na zdravila pri TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Znano je, da mutacije v genih za zaviranje tumorjev BRCA1 ali BRCA2 povečajo verjetnost za razvoj raka dojke pri ljudeh. Zdravljenje teh bolnic zahteva uporabo zaviralcev PARP. Poleg tega je bilo dokazano, da lahko z izključitvijo nukleotidnega rešilnega faktorja DNPH1 z uporabo CRISPR/Cas9 odstranimo toksični nukleotid 5-hidroksimetildeoksiuridin (hmdU) monofosfat, s čimer okrepimo odziv celic s pomanjkanjem BRCA na občutljivost na zaviralce PARP (Fugger et al., 2021). Zato bi lahko zaviralci CRISPR/Cas9 in PARP1 postali pomembna strategija zdravljenja TNBC.
Gen za penetrantni glikoprotein (P-gp) je gen za odpornost na več zdravil, ki je na splošno povečano izražen pri približno 41 % vseh primerov trinitrocelularnega dojčnega raka (TNBC) (Sun et al., 2020). Izločanje zdravil, ki ga povzroča P-gp, je bilo opredeljeno kot ključni regulator odpornosti na zdravila pri raku dojke. Zaviralci P-gp so pokazali povečano občutljivost na zdravila proti raku pri raku dojke (Famta et al., 2021). Zato je lahko ablacija ali supresija P-gp in zaviralcev P-gp, ki jo posreduje CRISPR/Cas9, zelo pomembna metoda za premagovanje odpornosti na zdravila pri TNBC.
Znano je, da ATP-vezavni kasetni transporter G2 (ABCG2) povzroča odpornost na zdravila pri TNBC (Palasuberniam et al., 2015), čeprav trenutno ni poročil o povezavi med utišanjem CRISPR/Cas9 in ABCG2 ter inaktivacijo genov tumorskega supresorja. PTEN lahko okrepi aktivacijo ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Zato je lahko uporaba CRISP/Ca9 za odstranitev ABCG2 in njegova kombinacija z zaviralcem ABCG2 primerno zdravljenje za premagovanje odpornosti na zdravila pri TNBC. V tabeli 2 je omenjen CRISPR/Cas9, ki cilja na vse gene odpornosti.
Tabela 2. CRISPR/Cas9 cilja na različne gene odpornosti TNBC, da bi celice senzibiliziral na zdravila proti raku.
Knjižnice CRISPR/Cas9 so potencialna orodja za presejanje genskih mutacij, povezanih s patogenezo raka (Chan et al., 2022). Ta metoda presejanja vključuje štiri korake, kot so (a) gradnja knjižnice, (b) lentivirusna transdukcija, (c) fenotipsko presejanje in (d) analiza ciljnih genov. Čeprav ima TNBC nenormalno aktivacijo poti MAPK, je klinična prognoza ciljne terapije MEK za bolnike s TNBC, ki nosijo mutacije v tumorskih supresorskih genih, kot so PTEN, RB1 in TP53, zelo slaba.
Poleg tega je bil s presejalnim testom za izločanje genov z uporabo CRISPR/Cas9 testiran najmočnejša in najselektivnejša molekula, dehidrokatrol, ki je v izvlečkih gvatemalskih cvetov in listov, da bi razumeli učinek dehidrokatrola na MDA-MB-231. Mehanizmi selektivne celične citotoksičnosti. Značilnosti mezenhimske matičnosti podtipov TNBC. Ta presejalni test na osnovi CRISPR/Cas9 je tudi pokazal, da je HSD17B11, gen, ki kodira 17β-hidroksisteroid dehidrogenazo tipa 11, močno izražen v celicah MDA-MB-231 in povzroči dehidrofalkarinol, specifičen za celice MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). To torej kaže, da ima genomski presejalni test CRISPR/Cas9 velik potencial pri prepoznavanju mehanizmov, ki so podlaga za protirakave lastnosti potencialnih naravnih spojin.
Poleg tega je bila ranljivost TNBC za raka proučevana z uporabo nepristranskega in vivo presejanja CRISPR/Cas9 na ravni celotnega genoma, ki je pokazalo povezavo med onkogenimi in tumorsupresorskimi potmi. Poročali so, da ključne komponente poti mTOR in Hippo igrajo pomembno vlogo pri regulaciji tumorjev pri TNBC. Poleg tega so študije pokazale, da farmakološka inhibicija onkoproteina mTORC1/2 in YAP učinkovito zavira patogenost TNBC z uporabo in vitro modela sinergije zdravila in matrike ter in vivo ksenograftov, pridobljenih od bolnikov. Poleg tega inhibicija mTORC1/2, ki jo posreduje Torin-1, okrepi makropinocitozo, medtem ko inhibicija YAP, ki jo povzroča verteporfin, vodi do smrti celic TNBC. Skupaj ti rezultati poudarjajo moč in robustnost presejanja CRISPR na ravni celotnega genoma in vivo za prepoznavanje novih in učinkovitih zdravljenj za TNBC (Dai et al., 2021).
Disregulacija imunskega sistema je pomemben dejavnik pri tumorogenezi. Rakave celice se izognejo imunskemu očistku tako, da zaobidejo obrambne mehanizme, vključno z motenjem aktivnosti imunskih celic v tumorskem mikrookolju in ogrožanjem imunskega sistema. Zato je lahko razvoj izboljšanega imunskega sistema ključni pristop k boju proti tumorjem. Uporaba genske modifikacije na osnovi CRISPR/Cas9 obravnava več vprašanj, povezanih z imunsko disfunkcijo, z različnih vidikov. CRISPR/Cas9 se uporablja za izboljšanje protitumorske imunosti proti raku dojke po naslednjih poteh (slika 3).
Slika 3. Imunoterapija s CRISPR/Cas9 cilja na celice TNBC. Izguba CDK5 in zmanjšanje števila PDL1 in CD155 okrepita imunski sistem. Prav tako izguba A2AR in zmanjšanje števila TAA, kot so HER2, mucin 1 in TEM8, povečata učinkovitost celic CAR-T pri uničevanju rakavih celic. Presejalni testi celic T, ki jih poganja CRISPR/Cas9, so pokazali, da motnje kinaze p38 povečajo protitumorsko aktivnost celic T. Celice T, modificirane s CRISPR/Cas9, povečajo izražanje TCR (receptorja celic T), kar ima za posledico protitumorsko aktivnost celic T.
Cilj imunoterapije je spodbuditi imunski sistem k napadu na rakave celice. Prekomerno izražanje imunskih kontrolnih beljakovin običajno preprečuje avtoimunske reakcije, vendar lahko pomaga raku, da se jim izogne ​​(Topalian et al., 2015). Te beljakovine preprečujejo imunske reakcije z vezavo na receptorje na površini imunskih celic. Več kontrolnih beljakovin (kot sta CD155 in PD-L1) cilja na receptor PD-1 na imunskih celicah in se izražajo pri raku dojke, zlasti pri TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Zmanjšanje izražanja PD-L1 ali njegovega receptorja z uporabo CRISPR/Cas9 lahko spodbudi imunski sistem k napadu na tumorje TNBC (Yahata et al., 2019). Poleg tega je bilo dokazano, da znižana ekspresija PD-L1 z delecijo CDK5, ki jo posreduje CRISPR/Cas9, zavira rast tumorja in vitro in in vivo (Deng et al., 2020). Zaviranje rasti v in vitro in in vivo modelih raka dojke kaže, da ima lahko zmanjšanje CD155, ki ga posreduje shRNA, terapevtski učinek na raka dojke (Gao et al., 2018).
Celice CAR T izražajo CAR-je, ki prepoznajo s tumorjem povezane antigene (TAA) in lahko z zaviranjem delovanja kontrolnih beljakovin povečajo svojo aktivnost (Li C. et al., 2020). Obstajajo različne potencialne tarče za zdravljenje s celicami CAR T pri raku dojke, vključno z več TAA, kot so HER2, mucin1 in TEM8 (Bajgain et al., 2018). Obstajajo dokazi, da so celice CAR T, ki ciljajo na mezotelin (prekomerno izražen v celicah TNBC BT-459), učinkovitejše proti raku, ko je PD-1 izločen z uporabo CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Vendar pa je izolacija celic T od bolnikov in njihovo nato urejanje ex vivo delovno intenziven in dolgotrajen postopek. Čeprav lahko univerzalne celice T zmanjšajo zahteve glede izolacije, je treba donorske celice T, ki izražajo humani levkocitni antigen (HLA) razreda I in receptor T-celic (TCR), odstraniti, da se preprečijo nepravilnosti presadka proti gostitelju (Ren et al., 2017, 2017a). Z uporabo CRISPR/Cas9 lahko HDR hkrati odstrani TCR in HLA ter izbije gen, ki kodira CAR. Študije so pokazale, da se CRISPR/Cas9 lahko uporabi za vnos CAR proti CD19 v lokus TCR, s čimer se učinkovito proizvajajo CAR brez izčrpavanja celic T (Dimitri et al., 2022). Razvite so bile multipleks tehnologije za ustvarjanje alogenskih celic CAR T z istočasnim odstranjevanjem TCR, beta-2-mikroglobulina (B2M), podenote HLA-I in drugih beljakovin, kot sta PD-1 in CTLA-4, ki imajo lahko večje protirakave lastnosti proti TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Uporaba CRISPR/Cas9 bi lahko izboljšala učinkovitost celic CAR-T. Znano je, da ima adenozin imunosupresivne lastnosti in lahko zmanjša imunost proti raku z blokiranjem delovanja celic T in aktiviranjem adenozinskih receptorjev A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Utišanje A2AR z uporabo CRISPR/Cas9 je znatno izboljšalo učinkovitost celic CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Znano je, da celice T kažejo različne fenotipske značilnosti, kot so celična ekspanzija, diferenciacija, oksidativni stres in genomski stres. Presejalni testi celic T na osnovi CRISPR/Cas9 so pokazali motnje v 25 različnih kinazah receptorjev celic T. Med njimi je bilo dokazano, da delecija kinaze p38 poveča protitumorsko aktivnost celic T, kar kaže, da je kinaza p38 ključni regulator regulacije celic CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Celice T je mogoče gensko modificirati z uporabo CRISPR/Cas9 za proizvodnjo visoko izraženih TCR. Prenos gensko modificiranih celic T bolnikom je pokazal močnejšo protirakavo aktivnost kot endogene celice T. Zato lahko endogeni TCR pri bolnikih konkurirajo gensko spremenjenim TCR, kar lahko vpliva na potencial imunoterapije raka. Da bi premagali to težavo, lahko uporaba CRISPR/Cas9 za odstranitev endogenega TCR-β v prejemnih celicah in posledično prenos celic TCR-β bolnikom z rakom pokaže boljše imunske odzive proti raku brez potrebe po spolni konkurenci endogenega TCR (Fan et al., 2018). Tako so TCR, z izjemo celic T, modificiranih s CRISPR, tisočkrat bolj občutljivi na tumorske antigene kot normalne celice T, transducirane s TCR. Poleg tega pri različnih levkemijah spremenjene celice T, ki jih generira γδ TCR+ CRISPR, kažejo večjo ekspresijo celic CD4+ in CD8+ T kot standardni prenos TCR (Legut et al., 2018). Tako so lahko modificirane celice T, ki jih generira CRISPR/Cas9, učinkovita metoda imunoterapije za premagovanje TNBC.
Integrini so molekule celične adhezije, ki so prisotne v celičnih transmembranah in spodbujajo vezavo celic na zunajcelični matriks (ECM) (Hamidi in Ivaska, 2018). Disregulacija integrinov je povezana z razvojem in migracijo raka s spreminjanjem zunajceličnega matriksa, kar vodi do preživetja rakavih celic v krvnem obtoku (Hamidi in Ivaska, 2018). Z zaviranjem integrina s CRISPR/Cas9 se upočasni napredovanje tumorja, metastaze in kolonizacija pri TNBC. Poročali so, da zaviranje integrina a5 (ITGA5) zmanjša migracijo in napredovanje celic pri drugih vrstah raka, kot je pljučni rak (Ju et al., 2017), kar kaže na to, da je integrin a5 lahko tudi ključni dejavnik pri patogenezi TNBC.
Ustvarjanje miši z izločitvijo z uporabo tradicionalnih metod embrionalnih matičnih celic (ES) je delovno intenziven, dolgotrajen in neučinkovit postopek. Traja mesece in leta, da se ES celice ciljajo s homologno rekombinacijo, vzrejajo himerne miši in jih nato križajo s heterozigotnimi mišmi, da se dobijo homozigotni potomci. Za ustvarjanje miši z več genetskimi mutacijami je potrebno kompleksno križanje. Vendar pa se je pri uporabi miši, ustvarjenih z ablacijo ES celic z uporabo CRISPR/Cas9 ali z mikroinjiciranjem komponent CRISPR/Cas9 v enocelična oplojena jajčeca, pojavilo veliko težav. Na primer, vnos sprememb se pogosto zgodi na bialelnih lokusih in ni gensko specifičen. Nedavno je bilo poročano, da lahko ES celice z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 hkrati vstavijo bialelne mutacije v do 5 genih (Nishizono et al., 2021). V ta namen so bile v ES celice hkrati transficirane mRNA Cas9 in pet gensko specifičnih gRNA. To poudarja obljubo in učinkovitost tega postopka, čeprav so se te mutacije morda prenesle, ko so bile vzrejene matične linije za proizvodnjo petkratnih knockout miši. Študija poroča tudi o presenetljivem odkritju: ES celice niso več potrebne za ustvarjanje gensko spremenjenih miši. Namesto tega so bile za odstranitev specifičnih genskih produktov v zarodke v enocelični fazi vbrizgane Cas9 mRNA in gRNA. Posledično so bile ustvarjene matične linije z knockoutom, ki jih je teoretično mogoče uporabiti za preučevanje posledic delecije genov pri miših (Qin et al., 2016). Tako CRISPR/Cas9 omogoča ustvarjanje transgenih miši za zdravljenje TNBC po nižjih stroških kot tradicionalni genski inženiring. Z uporabo sistema CRISPR/Cas je bil razvit nov model knockout miši, ki lahko uspešno uvede točkovne mutacije v enem ali več endogenih genih pri TNBC. Na podlagi tega koncepta je mogoče razviti tudi živalske modele TNBC z uporabo CRISPR/Cas9-posredovane delecije BRCA1 in p53, kar povzroči izgubo popravila HR, genomsko nestabilnost in mutantne fenotipe (Annunziato et al., 2020).
Trenutno se za diagnosticiranje TNBC uporabljajo različne metode, kot so mamografija, magnetna resonanca (MRI) in ultrazvok. Vendar imajo te metode nekatere omejitve. Mamografija se uporablja za diagnosticiranje lokalnega tkiva dojke in ne metastaz, kjer so se rakave celice preselile v druge organe. Ultrazvok ni zanesljiva metoda za diagnosticiranje TNBC (Chen in Lee-Felker, 2023). MRI ima večjo občutljivost kot ultrazvok in mamografija, vendar je njena diagnostična natančnost omejena (Sha in Chen, 2022). Biopsija tkiva je invaziven način za identifikacijo rakavih celic. Vendar pa lahko v nekaterih primerih biopsija zgreši rakavo tkivo, če se igla oddalji od območja zanimanja. Poleg tega je zelo draga in lahko travmatična za pacientko. TNBC je heterogena vrsta raka, zato biopsija morda ne bo zagotovila dovolj informacij o vrsti raka. Zato je nujno potrebna nova diagnostično zanesljiva metoda za odkrivanje TNBC. CRISPR/Cas9 lahko služi kot zelo občutljiva in minimalno invazivna alternativa za diagnosticiranje raka dojke. V ta namen se lahko strategije, ki temeljijo na CRISPR/Cas9, uporabijo za izboljšanje metod PCR za diagnozo TNBC. Najprej se proteina Cas9 in cpf1 sistema CRISPR uporabita za odstranitev nespecifične DNK, nato pa lahko ta dva proteina (Cas9 in cpf1) prepoznata zaporedje PAM, preden se vežeta na ciljno DNK (Deepak Singh et al., 2021). Tako lahko PCR identificira mutacije, povezane z razvojem raka. Več študij je sprejelo to strategijo, ki temelji na CRISPR, za odkrivanje različnih mutacij pri različnih vrstah raka (Safari et al., 2019). Tako lahko metode PCR, ki temeljijo na CRISPR, zmanjšajo odvisnost diagnoze TNBC od invazivnih metod, kot je imunohistokemija na osnovi biopsije.
Genotipske spremembe v regulaciji hormonskih receptorjev so bile dokazane tudi pri TNBC (Chen in Russo, 2009). Strategije PCR na osnovi CRISPR/Cas9 z uporabo mikročipov za diagnostiko na mestu oskrbe lahko učinkovito spremljajo te mutacije (Hajian et al., 2019). Zdravstvenim delavcem bi lahko zagotovile tudi ustrezne informacije o specifičnih mutacijah pri bolnikih s TNBC, kar bi lahko pomagalo izboljšati njihov potek zdravljenja. Vendar pa ima ta kombinirana tehnika omejitve. Zato so potrebne obsežne raziskave, preden se bo ta metoda CRISPR/Cas-PCR lahko uporabila v zdravstvu za diagnozo TNBC (Yang et al., 2019).