Diferencialna diagnoza pljučnih vozličkov, odkritih z računalniško tomografijo (CT), ostaja izziv v klinični praksi. Tukaj karakteriziramo globalni metabolom 480 vzorcev seruma, vključno z zdravimi kontrolnimi osebami, benignimi pljučnimi vozlički in pljučnim adenokarcinomom I. stopnje. Adenokarcinomi kažejo edinstvene metabolomske profile, medtem ko imajo benigni vozlički in zdravi posamezniki veliko podobnost v metabolomskih profilih. V skupini odkrivanja (n = 306) je bil identificiran niz 27 metabolitov za razlikovanje med benignimi in malignimi vozlički. AUC diskriminantnega modela v skupinah z notranjo validacijo (n = 104) in zunanjo validacijo (n = 111) je bil 0,915 oziroma 0,945. Analiza poti je pokazala povečane glikolitične metabolite, povezane z zmanjšanim triptofanom v serumu pljučnega adenokarcinoma v primerjavi z benignimi vozlički in zdravimi kontrolnimi osebami, in nakazala, da privzem triptofana spodbuja glikolizo v celicah pljučnega raka. Naša študija poudarja vrednost biomarkerjev serumskih metabolitov pri ocenjevanju tveganja za pljučne vozličke, odkrite s CT.
Zgodnja diagnoza je ključnega pomena za izboljšanje stopnje preživetja bolnikov z rakom. Rezultati ameriškega nacionalnega presejalnega preskušanja za pljučni rak (NLST) in evropske študije NELSON so pokazali, da lahko presejanje z nizkodozno računalniško tomografijo (LDCT) znatno zmanjša umrljivost zaradi pljučnega raka v skupinah z visokim tveganjem1,2,3. Od široke uporabe LDCT za presejanje pljučnega raka se incidenca naključnih radiografskih ugotovitev asimptomatskih pljučnih vozličev še naprej povečuje4. Pljučni vozliči so opredeljeni kot žariščne motnosti s premerom do 3 cm5. Soočamo se s težavami pri ocenjevanju verjetnosti malignosti in pri obravnavanju velikega števila pljučnih vozličev, ki jih naključno odkrijemo na LDCT. Omejitve CT lahko vodijo do pogostih kontrolnih pregledov in lažno pozitivnih rezultatov, kar vodi do nepotrebnih posegov in prekomernega zdravljenja6. Zato je treba razviti zanesljive in uporabne biomarkerje za pravilno prepoznavanje pljučnega raka v zgodnjih fazah in razlikovanje večine benignih vozličev ob začetnem odkrivanju7.
Celovita molekularna analiza krvi (serum, plazma, periferne krvne mononuklearne celice), vključno z genomiko, proteomiko ali metilacijo DNK8,9,10, je privedla do vse večjega zanimanja za odkrivanje diagnostičnih biomarkerjev za pljučni rak. Medtem metabolomski pristopi merijo celične končne produkte, na katere vplivajo endogeni in eksogeni učinki, zato se uporabljajo za napovedovanje nastopa in izida bolezni. Tekočinska kromatografija-tandemska masna spektrometrija (LC-MS) je zaradi visoke občutljivosti in velikega dinamičnega razpona, ki lahko zajema presnovke z različnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi11,12,13, pogosto uporabljena metoda za metabolomske študije. Čeprav se je globalna metabolomska analiza plazme/seruma uporabljala za identifikacijo biomarkerjev, povezanih z diagnozo pljučnega raka14,15,16,17 in učinkovitostjo zdravljenja18, je treba še veliko preučiti klasifikatorje serumskih presnovkov za razlikovanje med benignimi in malignimi pljučnimi vozlički. - obsežne raziskave.
Adenokarcinom in ploščatocelični karcinom sta dva glavna podtipa nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC). Različni presejalni testi CT kažejo, da je adenokarcinom najpogostejši histološki tip pljučnega raka1,19,20,21. V tej študiji smo uporabili ultrazmogljivo tekočinsko kromatografijo z visokoločljivostno masno spektrometrijo (UPLC-HRMS) za izvedbo metabolomske analize skupno 695 vzorcev seruma, vključno z zdravimi kontrolnimi osebami, benignimi pljučnimi vozliči in CT-odkritimi ≤3 cm. Presejalni testi za pljučni adenokarcinom stadija I. Opredelili smo panel serumskih metabolitov, ki ločujejo pljučni adenokarcinom od benignih vozličev in zdravih kontrolnih oseb. Analiza obogatitve poti je pokazala, da sta nenormalni metabolizem triptofana in glukoze pogosti spremembi pri pljučnem adenokarcinomu v primerjavi z benignimi vozliči in zdravimi kontrolnimi osebami. Nazadnje smo vzpostavili in potrdili serumski metabolni klasifikator z visoko specifičnostjo in občutljivostjo za razlikovanje med malignimi in benignimi pljučnimi vozliči, odkritimi z LDCT, kar lahko pomaga pri zgodnji diferencialni diagnozi in oceni tveganja.
V tej študiji so bili retrospektivno zbrani vzorci seruma, primerljivi po spolu in starosti, od 174 zdravih kontrolnih oseb, 292 bolnikov z benignimi pljučnimi vozlički in 229 bolnikov z adenokarcinomom pljuč 1. stopnje. Demografske značilnosti 695 oseb so prikazane v dodatni tabeli 1.
Kot je prikazano na sliki 1a, je bilo v Onkološkem centru Univerze Sun Yat-sen zbranih skupno 480 vzorcev seruma, vključno s 174 vzorci zdrave kontrolne skupine (HC), 170 benignimi vozlički (BN) in 136 vzorci pljučnega adenokarcinoma (LA) v stadiju I. Kohorta odkritja za neciljno metabolomsko profiliranje z uporabo ultrazmogljive tekočinske kromatografije z visokoločljivostno masno spektrometrijo (UPLC-HRMS). Kot je prikazano na dodatni sliki 1, so bili identificirani diferencialni metaboliti med LA in HC, LA in BN za vzpostavitev klasifikacijskega modela in nadaljnje raziskovanje analize diferencialnih poti. 104 vzorcev, ki jih je zbral Onkološki center Univerze Sun Yat-sen, in 111 vzorcev, ki sta jih zbrali dve drugi bolnišnici, je bilo podvrženih notranji oziroma zunanji validaciji.
a Študijska populacija v kohorti odkritja, ki je bila podvržena globalni analizi metabolomike seruma z uporabo ultrazmogljive tekočinske kromatografije z visokoločljivostno masno spektrometrijo (UPLC-HRMS). b Diskriminantna analiza delnih najmanjših kvadratov (PLS-DA) celotnega metaboloma 480 vzorcev seruma iz študijske kohorte, vključno z zdravimi kontrolnimi osebami (HC, n = 174), benignimi vozlički (BN, n = 170) in adenokarcinomom pljuč v stadiju I (Los Angeles, n = 136). +ESI, način pozitivne ionizacije z elektrosprejem, -ESI, način negativne ionizacije z elektrosprejem. c–e Presnovki s pomembno različno abundanco v dveh danih skupinah (dvostranski Wilcoxonov test predznačenih rangov, prilagojena vrednost p glede na stopnjo lažnih odkritij, FDR <0,05) so prikazani v rdeči (kratka sprememba > 1,2) in modri barvi (kratka sprememba < 0,83). ), prikazano na grafiki vulkana. f Hierarhični toplotni zemljevid združevanja, ki prikazuje pomembne razlike v številu označenih presnovkov med LA in BN. Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Skupni serumski metabolom 174 HC, 170 BN in 136 LA v skupini odkritij je bil analiziran z analizo UPLC-HRMS. Najprej smo pokazali, da se vzorci kontrole kakovosti (QC) tesno združujejo v središču modela nenadzorovane analize glavnih komponent (PCA), kar potrjuje stabilnost delovanja trenutne študije (dodatna slika 2).
Kot je prikazano v analizi delnih najmanjših kvadratov (PLS-DA) na sliki 1b, smo ugotovili jasne razlike med LA in BN, LA in HC v pozitivnem (+ESI) in negativnem (−ESI) načinu elektrosprejne ionizacije. Vendar pa med BN in HC v pogojih +ESI in -ESI nismo ugotovili pomembnih razlik.
Med LA in HC smo našli 382 diferencialnih značilnosti, 231 diferencialnih značilnosti med LA in BN ter 95 diferencialnih značilnosti med BN in HC (Wilcoxonov test predznačenih rangov, FDR <0,05 in večkratne spremembe >1,2 ali <0,83) (slika .1c-e). Vrhovi so bili nadalje označeni (dodatni podatki 3) v zbirki podatkov (knjižnica mzCloud/HMDB/Chemspider) z vrednostjo m/z, retencijskim časom in iskanjem masnega spektra fragmentacije (podrobnosti so opisane v razdelku o metodah)22. Nazadnje je bilo za LA v primerjavi z BN (slika 1f in dodatna tabela 2) oziroma LA v primerjavi z HC (dodatna slika 3 in dodatna tabela 2) identificiranih 33 oziroma 38 označenih metabolitov s pomembnimi razlikami v številčnosti. Nasprotno pa so bili v BN in HC identificirani le 3 metaboliti s pomembnimi razlikami v številčnosti (dodatna tabela 2), kar je skladno s prekrivanjem med BN in HC v PLS-DA. Ti diferencialni metaboliti zajemajo širok spekter biokemikalij (dodatna slika 4). Skupaj ti rezultati kažejo na pomembne spremembe v serumskem metabolomu, ki odražajo maligno transformacijo pljučnega raka v zgodnji fazi v primerjavi z benignimi pljučnimi vozlički ali zdravimi osebami. Medtem podobnost serumskega metaboloma BN in HC kaže, da imajo benigni pljučni vozlički lahko številne skupne biološke značilnosti z zdravimi posamezniki. Glede na to, da so mutacije gena za receptor epidermalnega rastnega faktorja (EGFR) pogoste pri pljučnem adenokarcinomu podtipa 23, smo želeli ugotoviti vpliv mutacij gonilnika na serumski metabolom. Nato smo analizirali celoten metabolomski profil 72 primerov s statusom EGFR v skupini pljučnega adenokarcinoma. Zanimivo je, da smo v analizi PCA našli primerljive profile med bolniki z mutacijo EGFR (n = 41) in bolniki z divjim tipom EGFR (n = 31) (dodatna slika 5a). Vendar smo identificirali 7 metabolitov, katerih številčnost se je pri bolnikih z mutacijo EGFR bistveno spremenila v primerjavi z bolniki z divjim tipom EGFR (t-test, p < 0,05 in kratnost spremembe > 1,2 ali < 0,83) (dodatna slika 5b). Večina teh metabolitov (5 od 7) so acilkarnitini, ki igrajo pomembno vlogo v poteh oksidacije maščobnih kislin.
Kot je prikazano v delovnem toku na sliki 2a, so bili biomarkerji za klasifikacijo vozličkov pridobljeni z uporabo operatorjev najmanjšega absolutnega krčenja in izbora na podlagi 33 diferencialnih metabolitov, identificiranih v LA (n = 136) in BN (n = 170). Najboljša kombinacija spremenljivk (LASSO) – binarni logistični regresijski model. Za preverjanje zanesljivosti modela je bila uporabljena desetkratna navzkrižna validacija. Izbor spremenljivk in regularizacija parametrov sta prilagojeni s kaznijo za maksimizacijo verjetnosti s parametrom λ24. Globalna metabolomska analiza je bila nadalje izvedena neodvisno v skupinah za notranjo validacijo (n = 104) in zunanjo validacijo (n = 111) za preverjanje učinkovitosti klasifikacije diskriminantnega modela. Posledično je bilo 27 metabolitov v naboru za odkrivanje identificiranih kot najboljši diskriminantni model z največjo povprečno vrednostjo AUC (slika 2b), med katerimi jih je imelo 9 povečano aktivnost in 18 zmanjšano aktivnost v LA v primerjavi z BN (slika 2c).
Potek dela za izgradnjo klasifikatorja pljučnih vozličkov, vključno z izbiro najboljšega panela serumskih metabolitov v naboru za odkrivanje z uporabo binarnega logističnega regresijskega modela prek desetkratne navzkrižne validacije in ocenjevanjem napovedne učinkovitosti v naborih za notranjo in zunanjo validacijo. b Statistika navzkrižne validacije regresijskega modela LASSO za izbor presnovnih biomarkerjev. Zgornje številke predstavljajo povprečno število izbranih biomarkerjev pri danem λ. Rdeča pikčasta črta predstavlja povprečno vrednost AUC pri ustrezni lambda. Sivi stolpci napak predstavljajo najmanjše in največje vrednosti AUC. Pikčasta črta označuje najboljši model z 27 izbranimi biomarkerji. AUC, površina pod krivuljo ROC (Receiver Operating Character). c Kratke spremembe 27 izbranih metabolitov v skupini LA v primerjavi s skupino BN v skupini za odkrivanje. Rdeči stolpec – aktivacija. Modri stolpec predstavlja upad. d–f Krivulje ROC (Receiver Operating Character), ki prikazujejo moč diskriminantnega modela na podlagi 27 kombinacij metabolitov v naborih za odkrivanje, notranjo in zunanjo validacijo. Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Na podlagi uteženih regresijskih koeficientov teh 27 metabolitov je bil ustvarjen napovedni model (dodatna tabela 3). ROC analiza, ki je temeljila na teh 27 metabolitih, je pokazala vrednost površine pod krivuljo (AUC) 0,933, občutljivost skupine odkritja 0,868 in specifičnost 0,859 (slika 2d). Medtem je med 38 označenimi diferencialnimi metaboliti med LA in HC niz 16 metabolitov dosegel AUC 0,902 z občutljivostjo 0,801 in specifičnostjo 0,856 pri razlikovanju LA od HC (dodatna slika 6a-c). Primerjali smo tudi vrednosti AUC, ki temeljijo na različnih pragih kratnosti spremembe za diferencialne metabolite. Ugotovili smo, da je klasifikacijski model najbolje deloval pri razlikovanju med LA in BN (HC), ko je bila raven kratnosti spremembe nastavljena na 1,2 v primerjavi z 1,5 ali 2,0 (dodatna slika 7a,b). Klasifikacijski model, ki je temeljil na 27 skupinah metabolitov, je bil nadalje potrjen v internih in eksternih kohortah. AUC je bil 0,915 (občutljivost 0,867, specifičnost 0,811) za interno validacijo in 0,945 (občutljivost 0,810, specifičnost 0,979) za zunanjo validacijo (slika 2e, f). Za oceno medlaboratorijske učinkovitosti je bilo v zunanjem laboratoriju analiziranih 40 vzorcev iz zunanje kohorte, kot je opisano v poglavju Metode. Natančnost klasifikacije je dosegla AUC 0,925 (dodatna slika 8). Ker je ploščatocelični karcinom pljuč (LUSC) drugi najpogostejši podtip nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) za pljučnim adenokarcinomom (LUAD), smo preizkusili tudi validirano potencialno uporabnost presnovnih profilov. BN in 16 primerov LUSC. AUC razlikovanja med LUSC in BN je bil 0,776 (dodatna slika 9), kar kaže na slabšo sposobnost v primerjavi z razlikovanjem med LUAD in BN.
Študije so pokazale, da je velikost vozličev na CT slikah pozitivno povezana z verjetnostjo malignosti in ostaja glavni dejavnik zdravljenja vozličev25,26,27. Analiza podatkov iz velike kohorte presejalne študije NELSON je pokazala, da je bilo tveganje za malignost pri osebah z bezgavkami <5 mm celo podobno kot pri osebah brez bezgavk28. Zato je najmanjša velikost, ki zahteva redno CT spremljanje, 5 mm, kot priporoča Britansko torakalno združenje (BTS), in 6 mm, kot priporoča Fleischnerjevo združenje29. Vendar pa vozliči, večji od 6 mm in brez očitnih benignih značilnosti, imenovani nedoločeni pljučni vozliči (IPN), ostajajo velik izziv pri ocenjevanju in zdravljenju v klinični praksi30,31. Nato smo z uporabo združenih vzorcev iz kohort odkrivanja in interne validacije preučili, ali velikost vozličev vpliva na metabolomske podpise. Z osredotočanjem na 27 validiranih biomarkerjev smo najprej primerjali PCA profile metabolomov HC in BN pod 6 mm. Ugotovili smo, da se večina podatkovnih točk za HC in BN prekriva, kar kaže na to, da so bile ravni serumskih presnovkov v obeh skupinah podobne (slika 3a). Značilnostni zemljevidi v različnih velikostnih razponih so ostali ohranjeni pri BN in LA (slika 3b, c), medtem ko je bila opažena ločitev med malignimi in benignimi vozliči v razponu od 6 do 20 mm (slika 3d). Ta kohorta je imela AUC 0,927, specifičnost 0,868 in občutljivost 0,820 za napovedovanje malignosti vozličev, ki merijo od 6 do 20 mm (slika 3e, f). Naši rezultati kažejo, da lahko klasifikator zajame presnovne spremembe, ki jih povzroča zgodnja maligna transformacija, ne glede na velikost vozliča.
ad Primerjava profilov PCA med določenimi skupinami na podlagi metabolnega klasifikatorja 27 metabolitov. CC in BN < 6 mm. b BN < 6 mm v primerjavi z BN 6–20 mm. v LA 6–20 mm v primerjavi z LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm in LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Krivulja ROC (Receiver Operating Character), ki prikazuje delovanje diskriminantnega modela za vozličke 6–20 mm. f Vrednosti verjetnosti so bile izračunane na podlagi logističnega regresijskega modela za vozličke, ki merijo 6–20 mm. Siva pikčasta črta predstavlja optimalno mejno vrednost (0,455). Zgornje številke predstavljajo odstotek primerov, predvidenih za Los Angeles. Uporabite dvostranski Studentov t-test. PCA, analiza glavnih komponent. Površina pod krivuljo AUC. Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Za ponazoritev delovanja predlaganega modela napovedovanja malignosti so bili izbrani štirje vzorci (stari od 44 do 61 let) s podobnimi velikostmi pljučnih vozličev (7–9 mm) (slika 4a, b). Pri začetnem presejanju se je primer 1 predstavil kot trden vozliček s kalcifikacijo, kar je značilnost, povezana z benignostjo, medtem ko se je primer 2 predstavil kot nedoločen delno trden vozliček brez očitnih benignih značilnosti. Trije krogi nadaljnjih CT preiskav so pokazali, da so ti primeri ostali stabilni v 4-letnem obdobju in so bili zato obravnavani kot benigni vozlički (slika 4a). V primerjavi s klinično oceno serijskih CT preiskav je analiza enkratnih serumskih metabolitov s trenutnim modelom klasifikacije hitro in pravilno identificirala te benigne vozličke na podlagi verjetnostnih omejitev (tabela 1). Slika 4b v primeru 3 prikazuje vozliček z znaki plevralne retrakcije, ki je najpogosteje povezana z malignostjo32. Primer 4 se je predstavil kot nedoločen delno trden vozliček brez dokazov o benignem vzroku. Vsi ti primeri so bili v skladu z modelom klasifikacije napovedani kot maligni (tabela 1). Ocena pljučnega adenokarcinoma je bila dokazana s histopatološkim pregledom po operaciji resekcije pljuč (slika 4b). Za zunanji validacijski nabor je metabolični klasifikator natančno napovedal dva primera nedoločenih pljučnih vozličev, večjih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT slike aksialnega okna pljuč dveh primerov benignih vozličev. V primeru 1 je CT po 4 letih pokazal stabilen soliden vozliček velikosti 7 mm s kalcifikacijo v desnem spodnjem režnju. V primeru 2 je CT po 5 letih pokazal stabilen, delno soliden vozliček s premerom 7 mm v desnem zgornjem režnju. b Slike aksialnega okna pljuč in ustrezne patološke študije dveh primerov adenokarcinoma stadija I pred resekcijo pljuč. Primer 3 je pokazal vozliček s premerom 8 mm v desnem zgornjem režnju z retrakcijo plevre. Primer 4 je pokazal delno soliden vozliček v obliki matiranega stekla velikosti 9 mm v levem zgornjem režnju. Obarvanje reseciranega pljučnega tkiva s hematoksilinom in eozinom (H&E) (merilo = 50 μm), ki prikazuje acinarni vzorec rasti pljučnega adenokarcinoma. Puščice označujejo vozličke, odkrite na CT slikah. Slike H&E so reprezentativne slike več (> 3) mikroskopskih polj, ki jih je pregledal patolog.
Naši rezultati skupaj kažejo na potencialno vrednost biomarkerjev serumskih presnovkov pri diferencialni diagnozi pljučnih vozličev, kar lahko predstavlja izziv pri ocenjevanju CT presejalnih preiskav.
Na podlagi validiranega diferencialnega panela metabolitov smo želeli identificirati biološke korelacije glavnih presnovnih sprememb. Analiza obogatitve poti KEGG, ki jo je izvedlo orodje MetaboAnalyst, je identificirala 6 skupnih, pomembno spremenjenih poti med obema skupinama (LA v primerjavi s HC in LA v primerjavi z BN, prilagojeno p ≤ 0,001, učinek > 0,01). Te spremembe so bile značilne za motnje v presnovi piruvata, presnovi triptofana, presnovi niacina in nikotinamida, glikolizi, ciklu TCA in presnovi purinov (slika 5a). Nato smo izvedli ciljno metabolomiko, da bi preverili glavne spremembe z absolutno kvantifikacijo. Določanje skupnih metabolitov v skupno spremenjenih poteh s trojno kvadrupolno masno spektrometrijo (QQQ) z uporabo avtentičnih standardov metabolitov. Demografske značilnosti ciljnega vzorca študije metabolomike so vključene v dodatno tabelo 4. V skladu z našimi globalnimi rezultati metabolomike je kvantitativna analiza potrdila, da so bili hipoksantin in ksantin, piruvat in laktat povečani v LA v primerjavi z BN in HC (slika 5b, c, p <0,05). Vendar pa med BN in HC niso bile ugotovljene pomembne razlike v teh metabolitih.
Analiza obogatitve poti KEGG za pomembno drugačne metabolite v skupini LA v primerjavi s skupinama BN in HC. Uporabljen je bil dvostranski globalni test, vrednosti p pa so bile prilagojene z metodo Holm-Bonferroni (prilagojen p ≤ 0,001 in velikost učinka > 0,01). b–d Violinski diagrami, ki prikazujejo ravni hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata in triptofana v serumu HC, BN in LA, določene z LC-MS/MS (n = 70 na skupino). Bele in črne pikčaste črte označujejo mediano oziroma kvartil. e Violinski diagram, ki prikazuje normalizirano izražanje mRNA SLC7A5 in QPRT v Log2TPM (transkripti na milijon) v pljučnem adenokarcinomu (n = 513) v primerjavi z normalnim pljučnim tkivom (n = 59) v naboru podatkov LUAD-TCGA. Beli okvir predstavlja interkvartilni razpon, vodoravna črna črta v sredini predstavlja mediano, navpična črna črta, ki se razteza iz okvirja, pa predstavlja 95-odstotni interval zaupanja (IZ). f Pearsonov korelacijski diagram izražanja SLC7A5 in GAPDH v pljučnem adenokarcinomu (n = 513) in normalnem pljučnem tkivu (n = 59) v naboru podatkov TCGA. Sivo območje predstavlja 95-odstotni IZ. r, Pearsonov korelacijski koeficient. g Normalizirane celične ravni triptofana v celicah A549, transficiranih z nespecifično kontrolo shRNA (NC) in shSLC7A5 (Sh1, Sh2), določene z LC-MS/MS. Predstavljena je statistična analiza petih biološko neodvisnih vzorcev v vsaki skupini. h Celične ravni NADt (skupni NAD, vključno z NAD+ in NADH) v celicah A549 (NC) in celicah A549 z zmanjšano ekspresijo SLC7A5 (Sh1, Sh2). Predstavljena je statistična analiza treh biološko neodvisnih vzorcev v vsaki skupini. i Glikolitično aktivnost celic A549 pred in po izločitvi SLC7A5 smo merili z zunajcelično hitrostjo zakisljevanja (ECAR) (n = 4 biološko neodvisni vzorci na skupino). 2-DG,2-deoksi-D-glukoza. V (b–h) je bil uporabljen dvostranski Studentov t-test. V (g–i) stolpci napak predstavljajo povprečje ± SD, vsak poskus je bil izveden trikrat neodvisno in rezultati so bili podobni. Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Glede na pomemben vpliv spremenjenega metabolizma triptofana v skupini LA smo z uporabo QQQ ocenili tudi ravni triptofana v serumu v skupinah HC, BN in LA. Ugotovili smo, da je bil serumski triptofan v LA zmanjšan v primerjavi s HC ali BN (p < 0,001, slika 5d), kar je skladno s prejšnjimi ugotovitvami, da so ravni triptofana v krvnem obtoku nižje pri bolnikih z rakom pljuč kot pri zdravih kontrolnih osebah iz kontrolne skupine33,34,35. Druga študija z uporabo PET/CT sledilnika 11C-metil-L-triptofana je pokazala, da je bil čas zadrževanja signala triptofana v tkivu pljučnega raka znatno povečan v primerjavi z benignimi lezijami ali normalnim tkivom36. Domnevamo, da lahko zmanjšanje triptofana v serumu LA odraža aktivno absorpcijo triptofana s strani celic pljučnega raka.
Znano je tudi, da je končni produkt kinureninske poti katabolizma triptofana NAD+37,38, ki je pomemben substrat za reakcijo gliceraldehid-3-fosfata z 1,3-bisfosfogliceratom v glikolizi39. Medtem ko so se prejšnje študije osredotočale na vlogo katabolizma triptofana pri imunski regulaciji, smo v tej študiji želeli pojasniti medsebojno delovanje med disregulacijo triptofana in glikolitičnimi potmi, ki smo jih opazili. Znano je, da je član 5 družine prenašalcev topljencev 7 (SLC7A5) prenašalec triptofana43,44,45. Kinolinska kislina fosforiboziltransferaza (QPRT) je encim, ki se nahaja nižje v signalni poti kinurenina in pretvarja kinolinsko kislino v NAMN46. Pregled nabora podatkov LUAD TCGA je pokazal, da sta bila tako SLC7A5 kot QPRT v tumorskem tkivu znatno povečana v primerjavi z normalnim tkivom (slika 5e). To povečanje so opazili v stadijih I in II ter v stadijih III in IV pljučnega adenokarcinoma (dodatna slika 11), kar kaže na zgodnje motnje v presnovi triptofana, povezane s tumorogenezo.
Poleg tega je nabor podatkov LUAD-TCGA pokazal pozitivno korelacijo med izražanjem mRNA SLC7A5 in GAPDH v vzorcih bolnikov z rakom (r = 0,45, p = 1,55E-26, slika 5f). Nasprotno pa med takimi genskimi podpisi v normalnem pljučnem tkivu ni bila ugotovljena pomembna korelacija (r = 0,25, p = 0,06, slika 5f). Zmanjšanje izražanja SLC7A5 (dodatna slika 12) v celicah A549 je znatno zmanjšalo celične ravni triptofana in NAD(H) (slika 5g,h), kar je povzročilo oslabljeno glikolitično aktivnost, merjeno z zunajcelično hitrostjo zakisljevanja (ECAR) (slika 1). 5i). Na podlagi presnovnih sprememb v serumu in detekcije in vitro torej domnevamo, da lahko presnova triptofana proizvaja NAD+ po kinureninski poti in igra pomembno vlogo pri spodbujanju glikolize pri pljučnem raku.
Študije so pokazale, da lahko veliko število nedoločenih pljučnih vozličev, odkritih z LDCT, privede do potrebe po dodatnih preiskavah, kot so PET-CT, biopsija pljuč in prekomerno zdravljenje zaradi lažno pozitivne diagnoze malignosti.31 Kot je prikazano na sliki 6, je naša študija opredelila skupino serumskih metabolitov s potencialno diagnostično vrednostjo, ki lahko izboljšajo stratifikacijo tveganja in nadaljnje zdravljenje pljučnih vozličev, odkritih s CT.
Pljučne vozličke ocenjujemo z nizkodozno računalniško tomografijo (LDCT) s slikovnimi značilnostmi, ki nakazujejo benigne ali maligne vzroke. Negotov izid pri vozličkih lahko vodi do pogostih kontrolnih pregledov, nepotrebnih posegov in pretiranega zdravljenja. Vključitev serumskih presnovnih klasifikatorjev z diagnostično vrednostjo lahko izboljša oceno tveganja in nadaljnje zdravljenje pljučnih vozličkov. PET pozitronska emisijska tomografija.
Podatki iz ameriške študije NLST in evropske študije NELSON kažejo, da lahko presejanje skupin z visokim tveganjem z nizkoodmerno računalniško tomografijo (LDCT) zmanjša umrljivost zaradi pljučnega raka1,3. Vendar pa ostajata ocena tveganja in posledično klinično zdravljenje velikega števila naključno odkritih pljučnih vozličkov z LDCT največji izziv. Glavni cilj je optimizirati pravilno klasifikacijo obstoječih protokolov, ki temeljijo na LDCT, z vključitvijo zanesljivih biomarkerjev.
Določeni molekularni biomarkerji, kot so krvni presnovki, so bili identificirani s primerjavo pljučnega raka z zdravimi kontrolnimi osebami15,17. V tej študiji smo se osredotočili na uporabo analize serumske metabolomike za razlikovanje med benignimi in malignimi pljučnimi vozliči, ki so bili naključno odkriti z LDCT. Primerjali smo globalni serumski metabolom zdravih kontrolnih oseb (HC), benignih pljučnih vozličev (BN) in vzorcev pljučnega adenokarcinoma (LA) I. stopnje z uporabo analize UPLC-HRMS. Ugotovili smo, da imata HC in BN podobne presnovne profile, medtem ko je LA pokazal pomembne spremembe v primerjavi s HC in BN. Identificirali smo dva niza serumskih presnovkov, ki razlikujeta LA od HC in BN.
Trenutna shema identifikacije benignih in malignih vozličev, ki temelji na LDCT, temelji predvsem na velikosti, gostoti, morfologiji in stopnji rasti vozličev skozi čas30. Prejšnje študije so pokazale, da je velikost vozličev tesno povezana z verjetnostjo pljučnega raka. Tudi pri bolnikih z visokim tveganjem je tveganje za malignost v bezgavkah <6 mm <1 %. Tveganje za malignost vozličev, ki merijo od 6 do 20 mm, se giblje od 8 % do 64 %30. Zato Fleischnerjeva družba priporoča mejni premer 6 mm za rutinsko CT spremljanje.29 Vendar pa ocena tveganja in zdravljenje nedoločenih pljučnih vozličev (IPN), večjih od 6 mm, nista bila ustrezno izvedena31. Trenutno zdravljenje prirojenih srčnih napak običajno temelji na budnem čakanju s pogostim CT spremljanjem.
Na podlagi validiranega metaboloma smo prvič pokazali prekrivanje metabolomskih podpisov med zdravimi posamezniki in benignimi vozlički <6 mm. Biološka podobnost je skladna s prejšnjimi ugotovitvami CT, da je tveganje za malignost pri vozličkih <6 mm tako nizko kot pri osebah brez vozličkov.30 Treba je opozoriti, da naši rezultati kažejo tudi, da imajo benigni vozlički <6 mm in ≥6 mm veliko podobnost v metabolomskih profilih, kar kaže na to, da je funkcionalna definicija benigne etiologije dosledna ne glede na velikost vozličkov. Tako lahko sodobni diagnostični paneli serumskih metabolitov zagotovijo en sam test kot izključitveni test, ko so vozlički prvotno odkriti na CT, in potencialno zmanjšajo serijsko spremljanje. Hkrati je isti panel presnovnih biomarkerjev razlikoval maligne vozličke velikosti ≥6 mm od benignih vozličkov in podal natančne napovedi za interlateralne nevtralne pnevmonijce podobne velikosti in dvoumnih morfoloških značilnosti na CT slikah. Ta klasifikator serumskega metabolizma se je dobro odrezal pri napovedovanju malignosti vozličkov ≥6 mm z AUC 0,927. Naši rezultati skupaj kažejo, da lahko edinstveni serumski metabolomski podpisi specifično odražajo zgodnje presnovne spremembe, ki jih povzroča tumor, in imajo potencialno vrednost kot napovedovalci tveganja, neodvisno od velikosti vozličev.
Omeniti velja, da sta pljučni adenokarcinom (LUAD) in ploščatocelični karcinom (LUSC) glavni vrsti nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC). Glede na to, da je LUSC močno povezan s kajenjem47 in da je LUAD najpogostejša histologija naključno odkritih pljučnih vozličkov pri CT presejanju48, je bil naš klasifikacijski model posebej izdelan za vzorce adenokarcinoma I. stopnje. Wang in sodelavci so se osredotočili tudi na LUAD in z uporabo lipidomike identificirali devet lipidnih podpisov za razlikovanje pljučnega raka v zgodnji fazi od zdravih posameznikov17. Trenutni klasifikacijski model smo preizkusili na 16 primerih LUSC I. stopnje in 74 benignih vozličkih ter opazili nizko natančnost napovedi LUSC (AUC 0,776), kar kaže na to, da imata LUAD in LUSC morda svoje metabolomske podpise. Dejansko se je pokazalo, da se LUAD in LUSC razlikujeta po etiologiji, biološkem izvoru in genetskih aberacijah49. Zato je treba v učne modele za odkrivanje pljučnega raka na populaciji v presejalnih programih vključiti tudi druge vrste histologije.
Tukaj smo opredelili šest najpogosteje spremenjenih poti pri pljučnem adenokarcinomu v primerjavi z zdravimi kontrolnimi osebami in benignimi vozlički. Ksantin in hipoksantin sta pogosta presnovka purinske presnovne poti. V skladu z našimi rezultati so bili intermediati, povezani s presnovo purinov, v serumu ali tkivih bolnikov z pljučnim adenokarcinomom znatno povečani v primerjavi z zdravimi kontrolnimi osebami ali bolniki v predinvazivni fazi15,50. Povišane ravni ksantina in hipoksantina v serumu lahko odražajo anabolizem, ki ga zahtevajo hitro proliferirajoče rakave celice. Disregulacija presnove glukoze je dobro znan znak presnove raka51. Tukaj smo opazili znatno povečanje piruvata in laktata v skupini LA v primerjavi s skupino HC in BN, kar je skladno s prejšnjimi poročili o nepravilnostih glikolitičnih poti v profilih serumskega metaboloma bolnikov z nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC) in zdravih kontrolnih oseb. Rezultati so skladni52,53.
Pomembno je, da smo v serumu pljučnih adenokarcinomov opazili obratno korelacijo med presnovo piruvata in triptofana. Serumske ravni triptofana so bile v skupini LA nižje v primerjavi s skupino HC ali BN. Zanimivo je, da je prejšnja obsežna študija s prospektivno kohorto ugotovila, da so nizke ravni triptofana v krvnem obtoku povezane s povečanim tveganjem za pljučnega raka 54. Triptofan je esencialna aminokislina, ki jo v celoti dobimo s hrano. Sklepamo, da lahko zmanjšanje serumskega triptofana pri pljučnem adenokarcinomu odraža hitro izčrpavanje tega presnovka. Dobro je znano, da je končni produkt katabolizma triptofana prek kinureninske poti vir de novo sinteze NAD+. Ker se NAD+ proizvaja predvsem prek poti reševanja, pomen NAD+ pri presnovi triptofana v zdravju in bolezni še ni določen 46. Naša analiza baze podatkov TCGA je pokazala, da je bila ekspresija transporterja triptofana, topljenca 7A5 (SLC7A5), pri pljučnem adenokarcinomu znatno povečana v primerjavi z normalnimi kontrolnimi osebami in je bila pozitivno povezana z ekspresijo glikolitičnega encima GAPDH. Prejšnje študije so se osredotočale predvsem na vlogo katabolizma triptofana pri zaviranju protitumorskega imunskega odziva40,41,42. Tukaj dokazujemo, da zaviranje privzema triptofana z zmanjšanjem SLC7A5 v celicah pljučnega raka povzroči posledično zmanjšanje ravni NAD v celicah in sočasno zmanjšanje glikolitične aktivnosti. Skratka, naša študija zagotavlja biološko osnovo za spremembe v serumskem metabolizmu, povezane z maligno transformacijo pljučnega adenokarcinoma.
Mutacije EGFR so najpogostejše gonilne mutacije pri bolnikih z nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC). V naši študiji smo ugotovili, da so imeli bolniki z mutacijo EGFR (n = 41) splošne metabolomske profile, podobne bolnikom z divjim tipom EGFR (n = 31), čeprav smo pri nekaterih bolnikih z mutacijo EGFR pri bolnikih z acilkarnitinom ugotovili znižane serumske ravni. Uveljavljena funkcija acilkarnitinov je transport acilnih skupin iz citoplazme v mitohondrijski matriks, kar vodi do oksidacije maščobnih kislin za proizvodnjo energije 55. V skladu z našimi ugotovitvami je nedavna študija z analizo globalnega metaboloma 102 vzorcev tkiva pljučnega adenokarcinoma50 odkrila podobne profile metaboloma med tumorji z mutacijo EGFR in divjim tipom EGFR. Zanimivo je, da je bila vsebnost acilkarnitina ugotovljena tudi v skupini z mutacijo EGFR. Zato bi bilo morda treba nadaljnje preučiti, ali spremembe v ravneh acilkarnitina odražajo presnovne spremembe, ki jih povzroča EGFR, in osnovne molekularne poti.
Skratka, naša študija vzpostavlja serumski metabolični klasifikator za diferencialno diagnozo pljučnih vozličev in predlaga potek dela, ki lahko optimizira oceno tveganja in olajša klinično zdravljenje na podlagi presejalnih posnetkov CT.
To študijo je odobril Etični odbor Onkološke bolnišnice Univerze Sun Yat-sen, Prva pridružena bolnišnica Univerze Sun Yat-sen in Etični odbor Onkološke bolnišnice Univerze Zhengzhou. V skupinah za odkrivanje in notranjo validacijo je bilo zbranih 174 serumov zdravih posameznikov in 244 serumov benignih vozličev od posameznikov, ki so se letno zdravniško pregledovali na Oddelku za nadzor in preprečevanje raka Onkološkega centra Univerze Sun Yat-sen, ter 166 serumov benignih vozličev. Adenokarcinomi pljuč stadija I so bili zbrani iz Onkološkega centra Univerze Sun Yat-sen. V kohorti za zunanjo validacijo je bilo 48 primerov benignih vozličev, 39 primerov adenokarcinoma pljuč stadija I iz Prve pridružene bolnišnice Univerze Sun Yat-sen in 24 primerov adenokarcinoma pljuč stadija I iz Onkološke bolnišnice Zhengzhou. Onkološki center Univerze Sun Yat-sen je zbral tudi 16 primerov ploščatoceličnega pljučnega raka stadija I, da bi preizkusil diagnostično sposobnost uveljavljenega metabolnega klasifikatorja (značilnosti bolnikov so prikazane v dodatni tabeli 5). Vzorci iz kohorte odkrivanja in interne validacijske kohorte so bili zbrani med januarjem 2018 in majem 2020. Vzorci za zunanjo validacijsko kohorto so bili zbrani med avgustom 2021 in oktobrom 2022. Da bi zmanjšali spolno pristranskost, je bilo vsaki kohorti dodeljenih približno enako število moških in ženskih primerov. Ekipa za odkrivanje in interna ocenjevalna ekipa. Spol udeležencev je bil določen na podlagi samoprijave. Od vseh udeležencev je bilo pridobljeno informirano soglasje in nadomestilo ni bilo zagotovljeno. Preiskovanci z benignimi vozlički so bili tisti s stabilnim rezultatom CT-preiskave pri 2 do 5 letih v času analize, razen 1 primera iz vzorca za zunanjo validacijo, ki je bil odvzet pred operacijo in diagnosticiran s histopatologijo. Z izjemo kroničnega bronhitisa. Primeri pljučnega adenokarcinoma so bili zbrani pred resekcijo pljuč in potrjeni s patološko diagnozo. Vzorci krvi na tešče so bili zbrani v epruvete za ločevanje seruma brez kakršnih koli antikoagulantov. Vzorci krvi so bili strjeni 1 uro pri sobni temperaturi in nato centrifugirani pri 2851 × g 10 minut pri 4 °C, da so zbrali serumski supernatant. Alikvote seruma so zamrznili pri -80 °C do ekstrakcije metabolitov. Oddelek za preprečevanje raka in zdravniške preglede Onkološkega centra Univerze Sun Yat-sen je zbral skupni vzorec seruma od 100 zdravih darovalcev, vključno z enakim številom moških in žensk, starih od 40 do 55 let. Zmešali so enake količine vzorca vsakega darovalca, nastali skupni vzorec pa so razdelili na alikvote in shranili pri -80 °C. Mešanica seruma je bila uporabljena kot referenčni material za nadzor kakovosti in standardizacijo podatkov.
Referenčni serum in testni vzorci so bili odtajani, metaboliti pa ekstrahirani z metodo kombinirane ekstrakcije (MTBE/metanol/voda) 56. Na kratko, 50 μl seruma je bilo zmešanih z 225 μl ledeno hladnega metanola in 750 μl ledeno hladnega metil terc-butil etra (MTBE). Zmes je bila premešana in inkubirana na ledu 1 uro. Vzorce je bilo nato premešanih in v vrtinčnem mešalniku zmešanih s 188 μl vode MS kakovosti, ki je vsebovala interne standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin in 13C6-izolevcin, kupljene pri Cambridge Isotope Laboratories). Zmes je bila nato centrifugirana pri 15.000 × g 10 minut pri 4 °C, spodnja faza pa je bila prenesena v dve epruveti (po 125 μL) za LC-MS analizo v pozitivnem in negativnem načinu. Na koncu je bil vzorec uparjen do suhega v visokohitrostnem vakuumskem koncentratorju.
Posušene metabolite smo rekonstituirali v 120 μl 80 % acetonitrila, mešali v vrtinčniku 5 minut in centrifugirali pri 15.000 × g 10 minut pri 4 °C. Supernatante smo prenesli v jantarne steklene viale z mikrovstavki za metabolomske študije. Neciljna metabolomska analiza na platformi ultrazmogljive tekočinske kromatografije z visokoločljivostno masno spektrometrijo (UPLC-HRMS). Metabolite smo ločili z uporabo sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC in kolone ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). V načinu pozitivnih ionov sta bili mobilni fazi 95 % (A) in 50 % acetonitrila (B), vsaka je vsebovala 10 mmol/L amonijevega acetata in 0,1 % mravljinčne kisline. V negativnem načinu sta mobilni fazi A in B vsebovali 95 % oziroma 50 % acetonitrila, obe fazi pa sta vsebovali 10 mmol/L amonijevega acetata, pH = 9. Gradientni program je bil naslednji: 0–0,5 min, 2 % B; 0,5–12 min, 2–50 % B; 12–14 min, 50–98 % B; 14–16 min, 98 % B; 16–16,1 min, 98 –2 % B; 16,1–20 min, 2 % B. Kolono smo vzdrževali pri 40 °C, vzorec pa pri 10 °C v avtosamplerju. Pretok je bil 0,3 ml/min, injekcijski volumen pa 3 μl. Masni spektrometer Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) z virom elektrosprejne ionizacije (ESI) je deloval v načinu polnega skeniranja in povezan z načinom spremljanja ddMS2 za zbiranje velikih količin podatkov. Parametri MS so bili nastavljeni na naslednji način: napetost pršenja +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura kapilare 320 °C, zaščitni plin 40 arb, pomožni plin 10 arb, temperatura grelnika sonde 350 °C, območje skeniranja 70–1050 m/h, ločljivost 70 000. Podatki so bili pridobljeni z uporabo programa Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za oceno kakovosti podatkov so bili združeni vzorci za kontrolo kakovosti (QC) ustvarjeni z odvzemom 10 μL alikvotov supernatanta iz vsakega vzorca. Na začetku analitskega zaporedja je bilo analiziranih šest injekcij vzorcev za kontrolo kakovosti, da bi ocenili stabilnost sistema UPLC-MS. Vzorci za kontrolo kakovosti se nato periodično vnašajo v serijo. Vseh 11 serij vzorcev seruma v tej študiji je bilo analiziranih s LC-MS. Alikvoti mešanice seruma 100 zdravih darovalcev so bili uporabljeni kot referenčni material v posameznih serijah za spremljanje procesa ekstrakcije in prilagajanje učinkov med serijami. Neciljna metabolomska analiza kohorte odkritja, interne validacijske kohorte in eksterne validacijske kohorte je bila izvedena v Centru za metabolomiko Univerze Sun Yat-sen. Zunanji laboratorij Centra za analizo in testiranje Tehnološke univerze Guangdong je analiziral tudi 40 vzorcev iz zunanje kohorte, da bi preizkusil delovanje modela klasifikatorja.
Po ekstrakciji in rekonstituciji je bila absolutna kvantifikacija serumskih metabolitov izmerjena z uporabo ultra visokozmogljive tekočinske kromatografije v tandemu s tekočinsko spektrometrijo (Agilent 6495 trojni kvadrupol) z virom elektrosprejne ionizacije (ESI) v načinu večkratnega spremljanja reakcij (MRM). Za ločevanje metabolitov je bila uporabljena kolona ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). Mobilna faza je bila sestavljena iz 90 % (A) in 5 % acetonitrila (B) z 10 mmol/L amonijevega acetata in 0,1 % raztopine amoniaka. Gradientni program je bil naslednji: 0–1,5 min, 0 % B; 1,5–6,5 min, 0–15 % B; 6,5–8 min, 15 % B; 8–8,5 min, 15 %–0 % B; 8,5–11,5 min, 0 % B. Kolono smo v avtomatskem vzorčevalniku vzdrževali pri 40 °C, vzorec pa pri 10 °C. Pretok je bil 0,3 mL/min, injekcijski volumen pa 1 μL. Parametri MS so bili nastavljeni na naslednji način: kapilarna napetost ±3,5 kV, tlak v nebulizatorju 35 psi, pretok plina v ovoju 12 l/min, temperatura plina v ovoju 350 °C, temperatura sušilnega plina 250 °C in pretok sušilnega plina 14 l/min. Konverzije MRM triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina in ksantina so bile 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 oziroma 151,0–107,9. Podatki so bili zbrani z uporabo programa Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). V vzorcih seruma so bili triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin in ksantin kvantificirani z uporabo umeritvenih krivulj standardnih mešanic raztopin. V celičnih vzorcih je bila vsebnost triptofana normalizirana na interni standard in maso celičnih beljakovin.
Ekstrakcija vrhov (m/z in retencijski čas (RT)) je bila izvedena z uporabo Compound Discovery 3.1 in TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Za odpravo morebitnih razlik med serijami je bil vsak značilni vrh testnega vzorca deljen s značilnim vrhom referenčnega materiala iz iste serije, da bi dobili relativno abundanco. Relativni standardni odkloni internih standardov pred in po standardizaciji so prikazani v dodatni tabeli 6. Razlike med obema skupinama so bile označene s stopnjo lažnih odkritij (FDR < 0,05, Wilcoxonov test predznačenih rangov) in kratnostjo spremembe (> 1,2 ali < 0,83). Surovi MS podatki ekstrahiranih značilnosti in referenčni serumsko popravljeni MS podatki so prikazani v dodatnih podatkih 1 oziroma dodatnih podatkih 2. Opomba vrhov je bila izvedena na podlagi štirih definiranih ravni identifikacije, vključno z identificiranimi metaboliti, domnevno označenimi spojinami, domnevno karakteriziranimi razredi spojin in neznanimi spojinami 22. Na podlagi iskanja v zbirki podatkov v programu Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) so bile kot vmesni produkti med diferencialnim metabolomom končno izbrane biološke spojine z validiranimi standardi MS/MS ali natančnimi ujemanjem v mzCloud (rezultat > 85) ali Chemspider. Opombe vrhov za vsako značilnost so vključene v Dodatne podatke 3. Za univariatno analizo vsoto normalizirane številčnosti metabolitov je bil uporabljen program MetaboAnalyst 5.0. MetaboAnalyst 5.0 je ovrednotil tudi analizo obogatitve poti KEGG na podlagi pomembno različnih metabolitov. Analiza glavnih komponent (PCA) in diskriminantna analiza delnih najmanjših kvadratov (PLS-DA) sta bili analizirani z uporabo programskega paketa ropls (v.1.26.4) z normalizacijo sklada in samodejnim skaliranjem. Optimalni model biomarkerja metabolitov za napovedovanje malignosti vozličev je bil ustvarjen z uporabo binarne logistične regresije z najmanjšim absolutnim krčenjem in operatorjem izbora (LASSO, paket R v.4.1-3). Učinkovitost diskriminantnega modela v detekcijskih in validacijskih naborih je bila opredeljena z oceno AUC na podlagi ROC analize v skladu s paketom pROC (v.1.18.0.). Optimalna meja verjetnosti je bila določena na podlagi največjega Youdenovega indeksa modela (občutljivost + specifičnost – 1). Vzorci z vrednostmi, manjšimi ali večjimi od praga, bodo napovedani kot benigni vozlički oziroma pljučni adenokarcinom.
Celice A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) so bile gojene v gojišču F-12K, ki je vsebovalo 10 % FBS. V lentivirusni vektor pLKO.1-puro so bila vstavljena zaporedja kratkih lasnic RNA (shRNA), ki ciljajo na SLC7A5, in neciljna kontrola (NC). Protismiselna zaporedja shSLC7A5 so naslednja: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Protitelesa proti SLC7A5 (#5347) in tubulinu (#2148) so bila kupljena pri Cell Signaling Technology. Protitelesa proti SLC7A5 in tubulinu so bila uporabljena v razredčitvi 1:1000 za Western blot analizo.
Glikolitični stresni test Seahorse XF meri raven zunajcelične zakisljenosti (ECAR). V testu so bili glukoza, oligomicin A in 2-DG aplicirani zaporedno za testiranje celične glikolitične sposobnosti, merjene z ECAR.
Celice A549, transficirane z neciljno kontrolo (NC) in shSLC7A5 (Sh1, Sh2), smo čez noč nasadili v posodice s premerom 10 cm. Celične metabolite smo ekstrahirali z 1 ml ledeno mrzle 80-odstotne vodne raztopine metanola. Celice v metanolni raztopini smo postrgali, zbrali v novo epruveto in centrifugirali pri 15.000 × g 15 minut pri 4 °C. Zbrali smo 800 µl supernatanta in ga posušili z visokohitrostnim vakuumskim koncentratorjem. Posušene pelete metabolitov smo nato analizirali na raven triptofana z uporabo LC-MS/MS, kot je opisano zgoraj. Celične ravni NAD(H) v celicah A549 (NC in shSLC7A5) smo izmerili s kvantitativnim kolorimetričnim kompletom NAD+/NADH (#K337, BioVision) v skladu z navodili proizvajalca. Za vsak vzorec smo izmerili raven beljakovin, da bi normalizirali količino metabolitov.
Za predhodno določitev velikosti vzorca niso bile uporabljene statistične metode. Prejšnje metabolomske študije, namenjene odkrivanju biomarkerjev15,18, so bile upoštevane kot merila za določanje velikosti, in v primerjavi s temi poročili je bil naš vzorec ustrezen. Iz študijske kohorte ni bil izključen noben vzorec. Serumski vzorci so bili naključno dodeljeni skupini za odkrivanje (306 primerov, 74,6 %) in skupini za notranjo validacijo (104 primeri, 25,4 %) za neciljne metabolomske študije. Za ciljne metabolomske študije smo iz nabora za odkrivanje naključno izbrali tudi 70 primerov iz vsake skupine. Raziskovalci med zbiranjem in analizo podatkov LC-MS niso bili seznanjeni z dodelitvijo skupin. Statistične analize metabolomskih podatkov in celičnih poskusov so opisane v ustreznih razdelkih Rezultati, Legende slik in Metode. Kvantifikacija celičnega triptofana, NADT in glikolitične aktivnosti je bila izvedena trikrat neodvisno z enakimi rezultati.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek poročila o naravnem portfelju, ki je povezan s tem člankom.
Surovi MS podatki izvlečenih značilnosti in normalizirani MS podatki referenčnega seruma so prikazani v dodatnih podatkih 1 oziroma 2. Opombe vrhov za diferencialne značilnosti so predstavljene v dodatnih podatkih 3. Nabor podatkov LUAD TCGA lahko prenesete s spletne strani https://portal.gdc.cancer.gov/. Vhodni podatki za risanje grafa so navedeni v izvornih podatkih. Izvorni podatki so navedeni za ta članek.
Nacionalna študijska skupina za presejanje pljuč itd. Zmanjšanje umrljivosti zaradi pljučnega raka z nizkoodmerno računalniško tomografijo. Severna Anglija. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR in Prophet, PC Presejalni testi za pljučnega raka z uporabo nizkodozne spiralne CT: rezultati nacionalne študije presejanja pljuč (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ in sod. Zmanjšanje umrljivosti zaradi pljučnega raka z volumetričnim CT presejanjem v randomiziranem preskušanju. Severna Anglija. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Čas objave: 18. september 2023