Diferencialna diagnoza pljučnih nodulov, ugotovljenih z računalniško tomografijo (CT), ostaja izziv v klinični praksi.Tukaj opisujemo globalni metabolom 480 vzorcev seruma, vključno z zdravimi kontrolami, benignimi pljučnimi noduli in pljučnim adenokarcinomom stopnje I.Adenokarcinomi kažejo edinstvene presnovne profile, medtem ko imajo benigni noduli in zdravi posamezniki visoko podobnost v presnovnih profilih.V skupini za odkritje (n = 306) je bil identificiran niz 27 metabolitov za razlikovanje med benignimi in malignimi vozliči.AUC diskriminantnega modela v skupinah z notranjo validacijo (n = 104) in zunanjo validacijo (n = 111) je bila 0,915 oziroma 0,945.Analiza poti je pokazala povečane glikolitične presnovke, povezane z zmanjšanim triptofanom v serumu pljučnega adenokarcinoma v primerjavi z benignimi noduli in zdravimi kontrolami, in nakazala, da privzem triptofana spodbuja glikolizo v celicah pljučnega raka.Naša študija poudarja vrednost biomarkerjev metabolitov v serumu pri ocenjevanju tveganja za pljučne vozliče, odkrite s CT.
Zgodnja diagnoza je ključnega pomena za izboljšanje stopnje preživetja bolnikov z rakom.Rezultati ameriškega nacionalnega preskušanja za odkrivanje pljučnega raka (NLST) in evropske študije NELSON so pokazali, da lahko presejanje z nizkoodmerno računalniško tomografijo (LDCT) znatno zmanjša umrljivost zaradi pljučnega raka v skupinah z visokim tveganjem1,2,3.Od široke uporabe LDCT za presejanje pljučnega raka se je incidenca naključnih radiografskih ugotovitev asimptomatskih pljučnih nodulov še naprej povečevala 4 .Pljučni noduli so definirani kot žariščne motnosti s premerom do 3 cm 5 .Soočamo se s težavami pri ocenjevanju verjetnosti malignosti in obravnavi velikega števila pljučnih nodulov, ki jih naključno odkrijejo na LDCT.Omejitve CT lahko privedejo do pogostih kontrolnih pregledov in lažno pozitivnih rezultatov, kar vodi do nepotrebnega posega in prekomernega zdravljenja6.Zato je treba razviti zanesljive in uporabne biomarkerje za pravilno identifikacijo pljučnega raka v zgodnjih fazah in razlikovanje večine benignih vozličev ob začetnem odkrivanju 7 .
Celovita molekularna analiza krvi (seruma, plazme, mononuklearnih celic periferne krvi), vključno z genomiko, proteomiko ali metilacijo DNA 8,9,10, je povzročila naraščajoče zanimanje za odkrivanje diagnostičnih biomarkerjev za pljučnega raka.Medtem metabolomični pristopi merijo celične končne produkte, na katere vplivajo endogena in eksogena dejanja in se zato uporabljajo za napovedovanje začetka in izida bolezni.Tekočinska kromatografija-tandemska masna spektrometrija (LC-MS) je široko uporabljena metoda za študije metabolomike zaradi svoje visoke občutljivosti in velikega dinamičnega razpona, ki lahko zajema metabolite z različnimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi11,12,13.Čeprav je bila globalna metabolomska analiza plazme/seruma uporabljena za identifikacijo biomarkerjev, povezanih z diagnozo pljučnega raka14,15,16,17 in učinkovitostjo zdravljenja,18 je treba še veliko raziskati klasifikatorje serumskih presnovkov za razlikovanje med benignimi in malignimi pljučnimi noduli.- obsežne raziskave.
Adenokarcinom in ploščatocelični karcinom sta dva glavna podtipa nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC).Različni presejalni testi CT kažejo, da je adenokarcinom najpogostejši histološki tip pljučnega raka1,19,20,21.V tej študiji smo uporabili ultra zmogljivo tekočinsko kromatografijo z masno spektrometrijo visoke ločljivosti (UPLC-HRMS) za izvedbo metabolomske analize na skupno 695 vzorcih seruma, vključno z zdravimi kontrolami, benignimi pljučnimi noduli in CT-odkritimi ≤3 cm.Presejanje pljučnega adenokarcinoma I. stopnje.Identificirali smo skupino serumskih metabolitov, ki razlikujejo pljučni adenokarcinom od benignih nodulov in zdravih kontrol.Analiza obogatitve poti je pokazala, da sta nenormalni metabolizem triptofana in glukoze pogoste spremembe pri adenokarcinomu pljuč v primerjavi z benignimi noduli in zdravimi kontrolami.Končno smo vzpostavili in validirali serumski presnovni klasifikator z visoko specifičnostjo in občutljivostjo za razlikovanje med malignimi in benignimi pljučnimi noduli, odkritimi z LDCT, kar lahko pomaga pri zgodnji diferencialni diagnozi in oceni tveganja.
V trenutni študiji so bili vzorci seruma, ki ustrezajo spolu in starosti, retrospektivno zbrani pri 174 zdravih kontrolah, 292 bolnikih z benignimi pljučnimi vozlički in 229 bolnikih s pljučnim adenokarcinomom I. stopnje.Demografske značilnosti 695 oseb so prikazane v dodatni tabeli 1.
Kot je prikazano na sliki 1a, je bilo v Sun Yat-sen University Cancer Center zbranih skupno 480 vzorcev seruma, vključno s 174 zdravimi kontrolnimi (HC), 170 benignimi noduli (BN) in 136 vzorci pljučnega adenokarcinoma (LA) stopnje I.Kohorta odkritij za neciljano presnovno profiliranje z uporabo ultra zmogljive tekočinske kromatografije z masno spektrometrijo visoke ločljivosti (UPLC-HRMS).Kot je prikazano na dodatni sliki 1, so bili identificirani diferencialni metaboliti med LA in HC, LA in BN, da se vzpostavi klasifikacijski model in nadalje razišče diferencialna analiza poti.104 vzorcev, ki jih je zbral Sun Yat-sen University Cancer Center, in 111 vzorcev, ki sta jih zbrala dve drugi bolnišnici, je bilo podvrženih notranji oziroma zunanji validaciji.
študijska populacija v kohorti odkritja, ki je bila podvržena globalni analizi metabolomike seruma z uporabo ultra zmogljive tekočinske kromatografije z masno spektrometrijo visoke ločljivosti (UPLC-HRMS).b Delna diskriminantna analiza najmanjših kvadratov (PLS-DA) celotnega metaboloma 480 vzorcev seruma iz študijske kohorte, vključno z zdravimi kontrolami (HC, n = 174), benignimi noduli (BN, n = 170) in pljučnim adenokarcinomom I. stopnje (Los Angeles, n = 136).+ESI, način pozitivne ionizacije z elektrosprejem, -ESI, način negativne ionizacije z elektrosprejem.c–e Metaboliti s pomembno različnimi abundancami v dveh danih skupinah (dvorepi Wilcoxonov predznačeni rangni test, stopnja napačnega odkrivanja prilagojena vrednost p, FDR <0,05) so prikazani rdeče (kratna sprememba > 1,2) in modra (kratna sprememba < 0,83) .), prikazano na grafiki vulkana.f Hierarhična toplotna karta grozdenja, ki prikazuje pomembne razlike v številu označenih metabolitov med LA in BN.Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Skupni serumski metabolom 174 HC, 170 BN in 136 LA v odkriti skupini je bil analiziran z analizo UPLC-HRMS.Najprej pokažemo, da so vzorci nadzora kakovosti (QC) tesno združeni v središču modela nenadzorovane analize glavnih komponent (PCA), kar potrjuje stabilnost delovanja trenutne študije (dodatna slika 2).
Kot je prikazano v delni diskriminantni analizi najmanjših kvadratov (PLS-DA) na sliki 1b, smo ugotovili, da obstajajo jasne razlike med LA in BN, LA in HC v pozitivnih (+ESI) in negativnih (−ESI) načinih ionizacije z elektrosprejem .izolirana.Vendar pa ni bilo ugotovljenih pomembnih razlik med BN in HC v pogojih +ESI in -ESI.
Našli smo 382 diferencialnih značilnosti med LA in HC, 231 diferencialnih značilnosti med LA in BN ter 95 diferencialnih značilnosti med BN in HC (Wilcoxonov test rangiranja s predznakom, FDR <0,05 in večkratna sprememba >1,2 ali <0,83) (slika .1c-e )..Vrhovi so bili dodatno označeni (dodatni podatki 3) glede na podatkovno bazo (knjižnica mzCloud/HMDB/Chemspider) z vrednostjo m/z, retencijskim časom in iskanjem po masnem spektru fragmentacije (podrobnosti opisane v razdelku Metode) 22.Končno je bilo ugotovljenih 33 in 38 označenih metabolitov s pomembnimi razlikami v številčnosti za LA v primerjavi z BN (slika 1f in dodatna tabela 2) oziroma LA v primerjavi s HC (dodatna slika 3 oziroma dodatna tabela 2).Nasprotno pa so bili v BN in HC (dodatna tabela 2) identificirani samo 3 metaboliti s pomembnimi razlikami v številčnosti, kar je skladno s prekrivanjem med BN in HC v PLS-DA.Ti diferencialni metaboliti pokrivajo širok spekter biokemikalij (dodatna slika 4).Ti rezultati skupaj kažejo pomembne spremembe v serumskem metabolomu, ki odražajo maligno transformacijo zgodnjega stadija pljučnega raka v primerjavi z benignimi pljučnimi noduli ali zdravimi osebami.Medtem pa podobnost serumskega metaboloma BN in HC nakazuje, da lahko benigni pljučni noduli delijo številne biološke značilnosti z zdravimi posamezniki.Glede na to, da so genske mutacije receptorja epidermalnega rastnega faktorja (EGFR) pogoste pri podtipu 23 pljučnega adenokarcinoma, smo skušali ugotoviti vpliv gonilnih mutacij na serumski metabolom.Nato smo analizirali celoten presnovni profil 72 primerov s statusom EGFR v skupini pljučnega adenokarcinoma.Zanimivo je, da smo v analizi PCA (dodatna slika 5a) našli primerljive profile med bolniki z mutacijo EGFR (n = 41) in bolniki z divjim tipom EGFR (n = 31).Vendar smo identificirali 7 metabolitov, katerih številčnost je bila znatno spremenjena pri bolnikih z mutacijo EGFR v primerjavi z bolniki z divjim tipom EGFR (t test, p <0,05 in kratna sprememba> 1,2 ali <0,83) (dodatna slika 5b).Večina teh metabolitov (5 od 7) je acilkarnitinov, ki igrajo pomembno vlogo pri poteh oksidacije maščobnih kislin.
Kot je prikazano v delovnem procesu, prikazanem na sliki 2 a, so bili biomarkerji za klasifikacijo vozličkov pridobljeni z uporabo operaterjev najmanjšega absolutnega krčenja in izbire na podlagi 33 diferencialnih metabolitov, identificiranih v LA (n = 136) in BN (n = 170).Najboljša kombinacija spremenljivk (LASSO) – binarni logistični regresijski model.Za testiranje zanesljivosti modela je bila uporabljena desetkratna navzkrižna validacija.Izbira spremenljivk in regulacija parametrov se prilagodita s kaznijo maksimiranja verjetnosti s parametrom λ24.Analiza globalne metabolomike je bila nadalje izvedena neodvisno v skupinah za notranjo validacijo (n = 104) in zunanjo validacijo (n = 111), da bi preizkusili učinkovitost klasifikacije diskriminantnega modela.Posledično je bilo 27 metabolitov v nizu odkritij identificiranih kot najboljši diskriminantni model z največjo srednjo vrednostjo AUC (slika 2b), med katerimi jih je imelo 9 povečano aktivnost in 18 zmanjšano aktivnost v LA v primerjavi z BN (slika 2c).
Potek dela za izgradnjo klasifikatorja pljučnih nodulov, vključno z izbiro najboljše plošče serumskih metabolitov v naboru za odkrivanje z uporabo binarnega logističnega regresijskega modela prek desetkratne navzkrižne validacije in ocenjevanje napovedne učinkovitosti v notranjih in zunanjih validacijskih nizih.b Statistika navzkrižne validacije regresijskega modela LASSO za izbiro presnovnih biomarkerjev.Zgoraj navedene številke predstavljajo povprečno število biomarkerjev, izbranih pri danem λ.Rdeča pikčasta črta predstavlja povprečno vrednost AUC pri ustrezni lambdi.Sive vrstice napak predstavljajo najmanjšo in največjo vrednost AUC.Črtkana črta označuje najboljši model s 27 izbranimi biomarkerji.AUC, območje pod krivuljo obratovalne karakteristike sprejemnika (ROC).c Večkratne spremembe 27 izbranih metabolitov v skupini LA v primerjavi s skupino BN v skupini za odkrivanje.Rdeči stolpec – aktivacija.Modri stolpec je upad.d–f Krivulje obratovalnih karakteristik sprejemnika (ROC), ki prikazujejo moč diskriminantnega modela, ki temelji na 27 kombinacijah metabolitov v kompletih za odkrivanje, notranji in zunanji validaciji.Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Na podlagi tehtanih regresijskih koeficientov teh 27 presnovkov je bil ustvarjen napovedni model (dodatna tabela 3).Analiza ROC na podlagi teh 27 metabolitov je dala vrednost površine pod krivuljo (AUC) 0,933, občutljivost skupine odkritja je bila 0,868 in specifičnost 0,859 (slika 2d).Medtem je med 38 označenimi diferencialnimi metaboliti med LA in HC niz 16 metabolitov dosegel AUC 0,902 z občutljivostjo 0,801 in specifičnostjo 0,856 pri razlikovanju LA od HC (dodatna slika 6a-c).Primerjali so tudi vrednosti AUC, ki temeljijo na različnih pragovih spremembe kratnosti za diferencialne metabolite.Ugotovili smo, da se je klasifikacijski model najbolje obnesel pri razlikovanju med LA in BN (HC), ko je bila raven spremembe gube nastavljena na 1,2 v primerjavi z 1,5 ali 2,0 (dodatna slika 7a,b).Klasifikacijski model, ki temelji na 27 skupinah metabolitov, je bil nadalje potrjen v notranjih in zunanjih kohortah.AUC je bila 0,915 (občutljivost 0,867, specifičnost 0,811) za notranjo validacijo in 0,945 (občutljivost 0,810, specifičnost 0,979) za zunanjo validacijo (sl. 2e, f).Za oceno medlaboratorijske učinkovitosti je bilo 40 vzorcev iz zunanje kohorte analiziranih v zunanjem laboratoriju, kot je opisano v razdelku Metode.Natančnost razvrstitve je dosegla AUC 0,925 (dodatna slika 8).Ker je pljučni ploščatocelični karcinom (LUSC) drugi najpogostejši podtip nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) za pljučnim adenokarcinomom (LUAD), smo testirali tudi potrjeno potencialno uporabnost presnovnih profilov.BN in 16 primerov LUSC.AUC diskriminacije med LUSC in BN je bila 0,776 (dodatna slika 9), kar kaže na slabšo sposobnost v primerjavi z diskriminacijo med LUAD in BN.
Študije so pokazale, da je velikost vozličev na slikah CT pozitivno povezana z verjetnostjo malignosti in ostaja glavni dejavnik pri zdravljenju vozličev25,26,27.Analiza podatkov iz velike kohorte presejalne študije NELSON je pokazala, da je tveganje za malignost pri osebah z vozliči <5 mm celo podobno tistemu pri osebah brez vozlov 28 .Zato je najmanjša velikost, ki zahteva redno spremljanje CT, 5 mm, kot priporoča British Thoracic Society (BTS), in 6 mm, kot priporoča Fleischner Society 29 .Vendar vozliči, večji od 6 mm in brez očitnih benignih značilnosti, imenovani nedoločeni pljučni noduli (IPN), ostajajo velik izziv pri vrednotenju in zdravljenju v klinični praksi30,31.Nato smo preučili, ali je velikost nodula vplivala na presnovne podpise z uporabo združenih vzorcev iz odkritih in notranjih validacijskih kohort.Z osredotočanjem na 27 validiranih biomarkerjev smo najprej primerjali profile PCA metabolomov HC in BN pod 6 mm.Ugotovili smo, da se večina podatkovnih točk za HC in BN prekriva, kar dokazuje, da so bile ravni presnovkov v serumu podobne v obeh skupinah (slika 3a).Zemljevidi značilnosti v različnih velikostih so ostali ohranjeni v BN in LA (sl. 3b, c), medtem ko so opazili ločitev med malignimi in benignimi noduli v območju 6–20 mm (sl. 3d).Ta kohorta je imela AUC 0,927, specifičnost 0,868 in občutljivost 0,820 za napovedovanje malignosti vozlov, ki merijo od 6 do 20 mm (sl. 3e, f).Naši rezultati kažejo, da lahko klasifikator zajame presnovne spremembe, ki jih povzroči zgodnja maligna transformacija, ne glede na velikost nodula.
ad Primerjava profilov PCA med določenimi skupinami na podlagi presnovnega klasifikatorja 27 metabolitov.CC in BN < 6 mm.b BN < 6 mm v primerjavi z BN 6–20 mm.v LA 6–20 mm v primerjavi z LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm in LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Krivulja obratovalne karakteristike sprejemnika (ROC), ki prikazuje zmogljivost diskriminantnega modela za nodule 6–20 mm.f Vrednosti verjetnosti so bile izračunane na podlagi modela logistične regresije za nodule velikosti 6–20 mm.Siva pikčasta črta predstavlja optimalno mejno vrednost (0,455).Zgornje številke predstavljajo odstotek predvidenih primerov za Los Angeles.Uporabite dvostranski Studentov t test.PCA, analiza glavnih komponent.AUC območje pod krivuljo.Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Štirje vzorci (stari 44–61 let) s podobnimi velikostmi pljučnih nodulov (7–9 mm) so bili dodatno izbrani za ponazoritev učinkovitosti predlaganega modela napovedovanja malignosti (sl. 4a, b).Pri začetnem pregledu je bil primer 1 predstavljen kot trden vozel s kalcifikacijo, kar je značilnost, povezana z benignostjo, medtem ko je bil primer 2 predstavljen kot nedoločen delno trden vozel brez očitnih benignih značilnosti.Trije krogi nadaljnjih CT pregledov so pokazali, da so ti primeri ostali stabilni v 4-letnem obdobju in so se zato šteli za benigne vozliče (slika 4a).V primerjavi s klinično oceno serijskih CT-pregledov je analiza presnovkov v serumu z enim posnetkom s trenutnim modelom klasifikatorja hitro in pravilno identificirala te benigne vozliče na podlagi verjetnostnih omejitev (tabela 1).Slika 4b v primeru 3 prikazuje nodus z znaki plevralne retrakcije, ki je najpogosteje povezan z malignostjo32.Primer 4 predstavljen kot nedoločen delno trden vozlič brez znakov benignega vzroka.Vsi ti primeri so bili glede na model klasifikatorja predvideni kot maligni (tabela 1).Ocena pljučnega adenokarcinoma je bila dokazana s histopatološkim pregledom po operaciji resekcije pljuč (slika 4b).Za nabor zunanjih validacij je presnovni klasifikator natančno predvidel dva primera nedoločenih pljučnih nodulov, večjih od 6 mm (dodatna slika 10).
CT slike aksialnega okna pljuč dveh primerov benignih vozličkov.V primeru 1 je CT po 4 letih pokazal stabilen soliden vozlič velikosti 7 mm s kalcifikacijo v desnem spodnjem režnju.V primeru 2 je CT po 5 letih pokazal stabilen, delno čvrst vozlič s premerom 7 mm v desnem zgornjem režnju.b CT slike pljuč v aksialnem oknu in ustrezne patološke študije dveh primerov adenokarcinoma stopnje I pred resekcijo pljuč.Primer 3 je pokazal vozlič s premerom 8 mm v desnem zgornjem režnju s plevralno retrakcijo.Primer 4 je pokazal delno trden nodul iz brušenega stekla, ki je meril 9 mm v levem zgornjem režnju.Barvanje reseciranega pljučnega tkiva s hematoksilinom in eozinom (H&E) (premer lestvice = 50 μm), ki prikazuje acinarni vzorec rasti pljučnega adenokarcinoma.Puščice označujejo nodule, odkrite na slikah CT.Slike H&E so reprezentativne slike več (>3) mikroskopskih polj, ki jih pregleda patolog.
Naši rezultati skupaj kažejo potencialno vrednost biomarkerjev metabolitov v serumu pri diferencialni diagnozi pljučnih vozličkov, kar lahko predstavlja izziv pri ocenjevanju CT presejanja.
Na podlagi validirane diferencialne presnovne plošče smo skušali identificirati biološke korelate večjih presnovnih sprememb.Analiza obogatitve poti KEGG, ki jo je izvedel MetaboAnalyst, je identificirala 6 skupnih pomembno spremenjenih poti med dvema danima skupinama (LA v primerjavi s HC in LA v primerjavi z BN, prilagojeni p ≤ 0,001, učinek > 0,01).Za te spremembe so bile značilne motnje v presnovi piruvata, presnovi triptofana, presnovi niacina in nikotinamida, glikolizi, ciklu TCA in presnovi purina (slika 5a).Nato smo nadalje izvedli ciljno metabolomiko, da bi preverili večje spremembe z uporabo absolutne kvantifikacije.Določanje običajnih metabolitov v pogosto spremenjenih poteh s trojno kvadrupolno masno spektrometrijo (QQQ) z uporabo avtentičnih standardov metabolitov.Demografske značilnosti ciljnega vzorca študije metabolomike so vključene v dodatno tabelo 4. V skladu z našimi rezultati globalne metabolomike je kvantitativna analiza potrdila, da so bili hipoksantin in ksantin, piruvat in laktat povečani v LA v primerjavi z BN in HC (sl. 5b, c, p <0,05).Vendar pa med BN in HC niso ugotovili pomembnih razlik v teh presnovkih.
Analiza obogatitve poti KEGG bistveno različnih metabolitov v skupini LA v primerjavi s skupinama BN in HC.Uporabljen je bil dvostranski Globaltest, vrednosti p pa so bile prilagojene z metodo Holm-Bonferroni (prilagojen p ≤ 0,001 in velikost učinka > 0,01).b–d Grafi violinov, ki prikazujejo ravni hipoksantina, ksantina, laktata, piruvata in triptofana v serumu HC, BN in LA, določene z LC-MS/MS (n = 70 na skupino).Bele in črne pikčaste črte označujejo mediano oziroma kvartil.e Graf Violin, ki prikazuje normalizirano izražanje mRNA Log2TPM (prepisov na milijon) SLC7A5 in QPRT v pljučnem adenokarcinomu (n = 513) v primerjavi z normalnim pljučnim tkivom (n = 59) v naboru podatkov LUAD-TCGA.Belo polje predstavlja interkvartilni razpon, vodoravna črna črta v sredini predstavlja mediano, navpična črna črta, ki sega iz polja, pa predstavlja 95-odstotni interval zaupanja (CI).f Pearsonov korelacijski grafikon izražanja SLC7A5 in GAPDH v pljučnem adenokarcinomu (n = 513) in normalnem pljučnem tkivu (n = 59) v naboru podatkov TCGA.Sivo območje predstavlja 95 % IZ.r, Pearsonov korelacijski koeficient.g Normalizirane ravni celičnega triptofana v celicah A549, transficiranih z nespecifično kontrolo shRNA (NC) in shSLC7A5 (Sh1, Sh2), določeno z LC-MS/MS.Prikazana je statistična analiza petih biološko neodvisnih vzorcev v vsaki skupini.h Celične ravni NADt (celotni NAD, vključno z NAD+ in NADH) v celicah A549 (NC) in celicah SLC7A5 knockdown A549 (Sh1, Sh2).Prikazana je statistična analiza treh biološko neodvisnih vzorcev v vsaki skupini.i Glikolitično aktivnost celic A549 pred in po knockdownu SLC7A5 smo izmerili s stopnjo ekstracelularne zakisanosti (ECAR) (n = 4 biološko neodvisni vzorci na skupino).2-DG,2-deoksi-D-glukoza.V (b–h) je bil uporabljen dvostranski Studentov t test.V (g–i) stolpci napak predstavljajo povprečje ± SD, vsak poskus je bil izveden trikrat neodvisno in rezultati so bili podobni.Izvorni podatki so na voljo v obliki izvornih podatkovnih datotek.
Glede na pomemben vpliv spremenjenega metabolizma triptofana v skupini LA smo z uporabo QQQ ocenili tudi ravni triptofana v serumu v skupinah HC, BN in LA.Ugotovili smo, da je bil serumski triptofan zmanjšan v LA v primerjavi s HC ali BN (p < 0,001, slika 5d), kar je skladno s prejšnjimi ugotovitvami, da so ravni triptofana v obtoku nižje pri bolnikih s pljučnim rakom kot pri zdravih kontrolnih osebah iz kontrolne skupine33,34 ,35.Druga študija z uporabo PET/CT sledilnika 11C-metil-L-triptofana je pokazala, da je bil čas zadrževanja signala triptofana v tkivu pljučnega raka znatno povečan v primerjavi z benignimi lezijami ali normalnim tkivom36.Domnevamo, da lahko zmanjšanje triptofana v serumu LA odraža aktivno privzem triptofana s celicami pljučnega raka.
Znano je tudi, da je končni produkt kinureninske poti katabolizma triptofana NAD+37,38, ki je pomemben substrat za reakcijo gliceraldehid-3-fosfata z 1,3-bisfosfogliceratom v glikolizi39.Medtem ko so se prejšnje študije osredotočale na vlogo katabolizma triptofana pri imunski regulaciji, smo poskušali razjasniti medsebojno delovanje med disregulacijo triptofana in glikolitičnimi potmi, opaženimi v trenutni študiji.Znano je, da je član 5 družine prenašalcev raztopin 7 (SLC7A5) prenašalec triptofana 43, 44, 45.Fosforiboziltransferaza kinolinske kisline (QPRT) je encim, ki se nahaja dolvodno od kinureninske poti, ki pretvarja kinolinsko kislino v NAMN46.Pregled nabora podatkov LUAD TCGA je pokazal, da sta bila tako SLC7A5 kot QPRT v tumorskem tkivu v primerjavi z normalnim tkivom bistveno povečana (slika 5e).To povečanje so opazili v stopnjah I in II ter stopnjah III in IV pljučnega adenokarcinoma (dodatna slika 11), kar kaže na zgodnje motnje v presnovi triptofana, povezane s tumorigenezo.
Poleg tega je nabor podatkov LUAD-TCGA pokazal pozitivno korelacijo med izražanjem mRNA SLC7A5 in GAPDH v vzorcih bolnikov z rakom (r = 0,45, p = 1,55E-26, slika 5f).V nasprotju s tem ni bilo ugotovljene pomembne korelacije med takimi genskimi podpisi v normalnem pljučnem tkivu (r = 0,25, p = 0,06, slika 5f).Izločitev SLC7A5 (dodatna slika 12) v celicah A549 je bistveno zmanjšala ravni celičnega triptofana in NAD(H) (slika 5g,h), kar je povzročilo oslabljeno glikolitično aktivnost, merjeno z zunajcelično stopnjo zakisanosti (ECAR) (slika 1).5i).Tako na podlagi presnovnih sprememb v serumu in odkrivanja in vitro domnevamo, da lahko presnova triptofana povzroči NAD+ po kinureninski poti in ima pomembno vlogo pri spodbujanju glikolize pri pljučnem raku.
Študije so pokazale, da lahko veliko število nedoločenih pljučnih nodulov, ki jih odkrije LDCT, povzroči potrebo po dodatnem testiranju, kot je PET-CT, biopsija pljuč, in prekomerno zdravljenje zaradi lažno pozitivne diagnoze malignosti.31 Kot je prikazano na sliki 6, naša študija je identificirala skupino serumskih metabolitov s potencialno diagnostično vrednostjo, ki lahko izboljša stratifikacijo tveganja in kasnejše obvladovanje pljučnih vozličev, odkritih s CT.
Pljučne nodule ocenimo z nizkoodmerno računalniško tomografijo (LDCT) s slikovnimi značilnostmi, ki kažejo na benigne ali maligne vzroke.Negotov izid nodulov lahko privede do pogostih kontrolnih pregledov, nepotrebnih posegov in prekomernega zdravljenja.Vključitev serumskih presnovnih klasifikatorjev z diagnostično vrednostjo lahko izboljša oceno tveganja in kasnejše zdravljenje pljučnih nodulov.PET pozitronska emisijska tomografija.
Podatki iz ameriške študije NLST in evropske študije NELSON kažejo, da lahko presejanje skupin z visokim tveganjem z nizkoodmerno računalniško tomografijo (LDCT) zmanjša umrljivost zaradi pljučnega raka1,3.Vendar ostajata ocena tveganja in kasnejše klinično zdravljenje velikega števila naključnih pljučnih nodulov, ki jih odkrije LDCT, največji izziv.Glavni cilj je optimizirati pravilno klasifikacijo obstoječih protokolov, ki temeljijo na LDCT, z vključitvijo zanesljivih biomarkerjev.
Nekatere molekularne biomarkerje, kot so metaboliti v krvi, so identificirali s primerjavo pljučnega raka z zdravimi kontrolnimi osebami15,17.V trenutni študiji smo se osredotočili na uporabo analize serumske metabolomike za razlikovanje med benignimi in malignimi pljučnimi noduli, ki jih je slučajno odkril LDCT.Z analizo UPLC-HRMS smo primerjali globalni serumski metabolom zdrave kontrole (HC), vzorce benignih pljučnih nodulov (BN) in pljučnega adenokarcinoma (LA) stopnje I.Ugotovili smo, da imata HC in BN podobne presnovne profile, medtem ko je LA pokazala pomembne spremembe v primerjavi s HC in BN.Identificirali smo dva sklopa serumskih metabolitov, ki ločujeta LA od HC in BN.
Trenutna identifikacijska shema za benigne in maligne vozliče, ki temelji na LDCT, v glavnem temelji na velikosti, gostoti, morfologiji in hitrosti rasti vozličkov skozi čas30.Prejšnje študije so pokazale, da je velikost vozličev tesno povezana z verjetnostjo pljučnega raka.Tudi pri bolnikih z visokim tveganjem je tveganje za malignost v vozlih <6 mm <1 %.Tveganje za malignost pri nodulih, ki merijo od 6 do 20 mm, je od 8 % do 64 %30.Zato Fleischnerjevo društvo priporoča mejni premer 6 mm za rutinsko spremljanje s CT.29 Vendar pa ocena tveganja in zdravljenje nedoločenih pljučnih nodulov (IPN), večjih od 6 mm, nista bili ustrezno izvedeni 31 .Sedanje zdravljenje prirojenih srčnih napak običajno temelji na budnem čakanju s pogostim spremljanjem CT.
Na podlagi validiranega metaboloma smo prvič dokazali prekrivanje metabolomskih podpisov med zdravimi posamezniki in benignimi vozlički <6 mm.Biološka podobnost je skladna s prejšnjimi ugotovitvami CT, da je tveganje za malignost pri nodulih <6 mm tako nizko kot pri osebah brez vozličev.30 Treba je opozoriti, da naši rezultati tudi kažejo, da imajo benigni vozlički <6 mm in ≥6 mm visoko podobnost v presnovnih profilih, kar kaže na to, da je funkcionalna opredelitev benigne etiologije dosledna ne glede na velikost nodula.Tako lahko sodobne diagnostične presnovne plošče v serumu zagotovijo en sam test kot test za izključitev, ko so vozliči prvotno odkriti na CT in potencialno zmanjšajo serijsko spremljanje.Istočasno je isti panel presnovnih biomarkerjev razlikoval maligne vozliče velikosti ≥6 mm od benignih vozličev in zagotovil natančne napovedi za IPN podobne velikosti in dvoumne morfološke značilnosti na slikah CT.Ta klasifikator metabolizma seruma se je dobro odrezal pri napovedovanju malignosti vozlov ≥6 mm z AUC 0,927.Naši rezultati skupaj kažejo, da lahko edinstveni serumski presnovni podpisi specifično odražajo zgodnje s tumorjem povzročene presnovne spremembe in imajo potencialno vrednost kot napovedovalci tveganja, neodvisno od velikosti vozličkov.
Predvsem pljučni adenokarcinom (LUAD) in ploščatocelični karcinom (LUSC) sta glavni vrsti nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC).Glede na to, da je LUSC močno povezan z uporabo tobaka47 in je LUAD najpogostejša histologija naključnih pljučnih nodulov, odkritih pri CT pregledu48, je bil naš model klasifikatorja izdelan posebej za vzorce adenokarcinoma stopnje I.Wang in sodelavci so se osredotočili tudi na LUAD in identificirali devet lipidnih podpisov z uporabo lipidomike za razlikovanje zgodnjega stadija pljučnega raka od zdravih posameznikov17.Preizkusili smo trenutni model klasifikatorja na 16 primerih I. stopnje LUSC in 74 benignih vozličev ter opazili nizko natančnost napovedi LUSC (AUC 0,776), kar nakazuje, da imata LUAD in LUSC lahko lastne presnovne znake.Dejansko se je pokazalo, da se LUAD in LUSC razlikujeta v etiologiji, biološkem izvoru in genetskih aberacijah49.Zato je treba druge vrste histologije vključiti v modele usposabljanja za populacijsko odkrivanje pljučnega raka v presejalnih programih.
Tu smo identificirali šest najpogosteje spremenjenih poti pri pljučnem adenokarcinomu v primerjavi z zdravimi kontrolami in benignimi noduli.Ksantin in hipoksantin sta pogosta metabolita purinske presnovne poti.V skladu z našimi rezultati so bili intermediati, povezani s presnovo purina, znatno povečani v serumu ali tkivih bolnikov s pljučnim adenokarcinomom v primerjavi z zdravimi kontrolami ali bolniki v predinvazivni fazi15,50.Povišane ravni ksantina in hipoksantina v serumu lahko odražajo anabolizem, ki ga zahtevajo hitro razmnožujoče rakave celice.Disregulacija presnove glukoze je dobro znan znak presnove raka51.Tu smo opazili znatno povečanje piruvata in laktata v skupini LA v primerjavi s skupino HC in BN, kar je skladno s prejšnjimi poročili o nenormalnostih glikolitične poti v profilih serumskega metaboloma bolnikov z nedrobnoceličnim pljučnim rakom (NSCLC) in zdrave kontrole.rezultati so skladni52,53.
Pomembno je, da smo opazili inverzno korelacijo med presnovo piruvata in triptofana v serumu pljučnih adenokarcinomov.Serumske ravni triptofana so bile znižane v skupini LA v primerjavi s skupino HC ali BN.Zanimivo je, da je prejšnja obsežna študija z uporabo prospektivne kohorte pokazala, da so nizke ravni triptofana v obtoku povezane s povečanim tveganjem za pljučni rak 54 .Triptofan je esencialna aminokislina, ki jo v celoti dobimo s hrano.Sklepamo, da lahko zmanjšanje triptofana v serumu pri pljučnem adenokarcinomu odraža hitro zmanjšanje tega presnovka.Dobro je znano, da je končni produkt katabolizma triptofana po kinureninski poti vir de novo sinteze NAD+.Ker NAD+ nastaja predvsem po poti reševanja, je treba še določiti pomen NAD+ pri presnovi triptofana pri zdravju in boleznih46.Naša analiza baze podatkov TCGA je pokazala, da je bila ekspresija transporterja raztopine triptofana 7A5 (SLC7A5) znatno povečana pri pljučnem adenokarcinomu v primerjavi z normalnimi kontrolami in je bila v pozitivni korelaciji z ekspresijo glikolitičnega encima GAPDH.Prejšnje študije so se osredotočale predvsem na vlogo katabolizma triptofana pri zatiranju protitumorskega imunskega odziva 40, 41, 42.Tukaj dokazujemo, da zaviranje privzema triptofana z uničenjem SLC7A5 v celicah pljučnega raka povzroči kasnejše znižanje celičnih ravni NAD in sočasno zmanjšanje glikolitične aktivnosti.Če povzamemo, naša študija zagotavlja biološko osnovo za spremembe v serumskem metabolizmu, povezanem z maligno transformacijo pljučnega adenokarcinoma.
Mutacije EGFR so najpogostejše gonilne mutacije pri bolnikih z NSCLC.V naši študiji smo ugotovili, da so imeli bolniki z mutacijo EGFR (n = 41) splošne presnovne profile, podobne bolnikom z divjim tipom EGFR (n = 31), čeprav smo ugotovili znižane serumske ravni nekaterih bolnikov z mutacijo EGFR pri bolnikih z acilkarnitinom.Uveljavljena funkcija acilkarnitinov je transport acilnih skupin iz citoplazme v mitohondrijski matriks, kar vodi do oksidacije maščobnih kislin za proizvodnjo energije 55 .V skladu z našimi ugotovitvami je nedavna študija z analizo globalnega metaboloma 102 vzorcev tkiva pljučnega adenokarcinoma identificirala tudi podobne profile metabolomov med mutantnim EGFR in tumorji divjega tipa EGFR.Zanimivo je, da je bila vsebnost acilkarnitina ugotovljena tudi v skupini mutantov EGFR.Torej, ali spremembe ravni acilkarnitina odražajo presnovne spremembe, ki jih povzroča EGFR, in osnovne molekularne poti morda zaslužijo nadaljnje študije.
Na koncu naša študija vzpostavlja serumski presnovni klasifikator za diferencialno diagnozo pljučnih nodulov in predlaga potek dela, ki lahko optimizira oceno tveganja in olajša klinično upravljanje na podlagi presejanja s CT.
To študijo je odobril Odbor za etiko Univerzitetne bolnišnice za raka Sun Yat-sen, Prva pridružena bolnišnica Univerze Sun Yat-sen in Odbor za etiko Univerzitetne bolnišnice za raka Zhengzhou.V skupinah za odkrivanje in interno validacijo je bilo zbranih 174 serumov zdravih posameznikov in 244 serumov benignih vozličev posameznikov, ki so bili na letnih zdravniških pregledih na Oddelku za nadzor in preprečevanje raka Univerze Sun Yat-sen Cancer Center, ter 166 benignih vozličev.serum.Pljučni adenokarcinomi stopnje I so bili zbrani v centru za raka Univerze Sun Yat-sen.V zunanji validacijski kohorti je bilo 48 primerov benignih vozličkov, 39 primerov pljučnega adenokarcinoma stopnje I iz prve pridružene bolnišnice Univerze Sun Yat-sen in 24 primerov pljučnega adenokarcinoma stopnje I iz bolnišnice za raka Zhengzhou.Center za raka Univerze Sun Yat-sen je zbral tudi 16 primerov ploščatoceličnega pljučnega raka I. stopnje, da bi preizkusil diagnostično sposobnost uveljavljenega presnovnega klasifikatorja (značilnosti bolnikov so prikazane v dodatni tabeli 5).Vzorci iz odkrite kohorte in notranje validacijske kohorte so bili zbrani med januarjem 2018 in majem 2020. Vzorci za zunanjo validacijsko kohorto so bili zbrani med avgustom 2021 in oktobrom 2022. Da bi zmanjšali pristranskost glede na spol, je bilo vsakemu dodeljeno približno enako število moških in ženskih primerov. kohorta.Ekipa za odkrivanje in ekipa za notranji pregled.Spol udeleženca je bil določen na podlagi samoporočila.Informirano soglasje je bilo pridobljeno od vseh udeležencev in ni bilo zagotovljeno nobeno nadomestilo.Subjekti z benignimi noduli so bili tisti s stabilnim rezultatom CT pri 2 do 5 letih v času analize, razen 1 primera iz zunanjega validacijskega vzorca, ki je bil zbran predoperativno in diagnosticiran s histopatološko preiskavo.Z izjemo kroničnega bronhitisa.Primeri pljučnega adenokarcinoma so bili zbrani pred resekcijo pljuč in potrjeni s patološko diagnozo.Vzorci krvi na tešče so bili zbrani v epruvete za ločevanje seruma brez kakršnih koli antikoagulantov.Vzorce krvi smo strjevali 1 uro pri sobni temperaturi in nato centrifugirali pri 2851 × g 10 minut pri 4 °C, da smo zbrali serumski supernatant.Alikvote seruma smo zamrznili pri -80 °C do ekstrakcije metabolita.Oddelek za preprečevanje raka in zdravniški pregled Centra za raka Univerze Sun Yat-sen je zbral serum 100 zdravih darovalcev, vključno z enakim številom moških in žensk, starih od 40 do 55 let.Enake količine vsakega vzorca darovalca smo zmešali, dobljeni bazen alikvotirali in shranili pri -80 °C.Serumsko mešanico smo uporabili kot referenčni material za kontrolo kakovosti in standardizacijo podatkov.
Referenčni serum in testni vzorci so bili odmrznjeni in presnovki ekstrahirani s kombinirano ekstrakcijsko metodo (MTBE/metanol/voda) 56 .Na kratko, 50 μl seruma smo zmešali z 225 μl ledeno mrzlega metanola in 750 μl ledeno mrzlega metil terc-butil etra (MTBE).Zmes premešamo in inkubiramo na ledu 1 uro.Vzorci so bili nato premešani in vrtinčeno pomešani s 188 μl vode MS-grade, ki je vsebovala notranje standarde (13C-laktat, 13C3-piruvat, 13C-metionin in 13C6-izolevcin, kupljen pri Cambridge Isotope Laboratories).Zmes smo nato centrifugirali pri 15.000 × g 10 minut pri 4 °C in spodnjo fazo prenesli v dve epruveti (125 μL vsaka) za analizo LC-MS v pozitivnem in negativnem načinu.Nazadnje smo vzorec uparili do suhega v visokohitrostnem vakuumskem koncentratorju.
Posušene metabolite smo rekonstituirali v 120 μl 80% acetonitrila, vrtinčili 5 minut in centrifugirali pri 15.000 × g 10 minut pri 4 °C.Supernatante smo prenesli v viale iz jantarnega stekla z mikrovložki za študije metabolomike.Neciljana metabolomska analiza na platformi ultrazmogljive tekočinske kromatografije z masno spektrometrijo visoke ločljivosti (UPLC-HRMS).Metabolite smo ločili z uporabo sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC in ACQUITY BEH Amide kolone (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).V načinu pozitivnih ionov sta bili mobilni fazi 95 % (A) in 50 % acetonitril (B), od katerih je vsaka vsebovala 10 mmol/L amonijevega acetata in 0,1 % mravljinčne kisline.V negativnem načinu sta mobilni fazi A in B vsebovali 95 % oziroma 50 % acetonitrila, obe fazi sta vsebovali 10 mmol/L amonijevega acetata, pH = 9. Gradientni program je bil naslednji: 0–0,5 min, 2 % B;0,5–12 min, 2–50 % B;12–14 min, 50–98 % B;14–16 min, 98 % B;16–16.1.min, 98 –2 % B;16,1–20 min, 2 % B. Kolono smo vzdrževali pri 40 °C, vzorec pa pri 10 °C v avtomatskem vzorčevalniku.Hitrost pretoka je bila 0,3 ml/min, volumen injekcije je bil 3 μl.Masni spektrometer Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) z virom elektrosprejne ionizacije (ESI) je deloval v načinu polnega skeniranja in je bil povezan z načinom spremljanja ddMS2 za zbiranje velikih količin podatkov.Parametri MS so bili nastavljeni takole: razpršilna napetost +3,8 kV/- 3,2 kV, kapilarna temperatura 320°C, zaščitni plin 40 arb, pomožni plin 10 arb, temperatura grelnika sonde 350°C, območje skeniranja 70–1050 m/h, resolucija.70 000. Podatki so bili pridobljeni z uporabo Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Za oceno kakovosti podatkov so bili generirani združeni vzorci za kontrolo kakovosti (QC) z odstranitvijo 10 μL alikvotov supernatanta iz vsakega vzorca.Na začetku analitičnega zaporedja je bilo analiziranih šest injekcij vzorcev za nadzor kakovosti, da bi ocenili stabilnost sistema UPLC-MS.Vzorci za kontrolo kakovosti se nato občasno dodajajo v serijo.Vseh 11 serij vzorcev seruma v tej študiji je bilo analiziranih z LC-MS.Alikvoti zbrane mešanice seruma 100 zdravih darovalcev so bili uporabljeni kot referenčni material v ustreznih serijah za spremljanje postopka ekstrakcije in prilagajanje učinkov od serije do serije.Neciljana metabolomska analiza odkrite kohorte, notranje validacijske kohorte in zunanje validacijske kohorte je bila izvedena v Metabolomskem centru univerze Sun Yat-sen.Zunanji laboratorij Centra za analizo in testiranje tehnološke univerze Guangdong je prav tako analiziral 40 vzorcev iz zunanje kohorte, da bi preizkusil učinkovitost modela klasifikatorja.
Po ekstrakciji in rekonstituciji je bila izmerjena absolutna kvantifikacija serumskih metabolitov s tandemsko masno spektrometrijo s tekočinsko kromatografijo ultra visoke ločljivosti (trojni kvadrupol Agilent 6495) z virom elektrosprejne ionizacije (ESI) v načinu spremljanja več reakcij (MRM).Za ločevanje metabolitov smo uporabili kolono ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).Mobilna faza je bila sestavljena iz 90 % (A) in 5 % acetonitrila (B) z 10 mmol/L amonijevega acetata in 0,1 % raztopine amoniaka.Gradientni program je bil naslednji: 0–1,5 min, 0 % B;1,5–6,5 min, 0–15 % B;6,5–8 min, 15 % B;8–8,5 min, 15 %–0 % B;8,5–11,5 min, 0 %B.Kolono smo vzdrževali pri 40 °C, vzorec pa pri 10 °C v avtomatskem vzorčevalniku.Hitrost pretoka je bila 0,3 ml/min in volumen injekcije 1 μL.Parametri MS so bili nastavljeni na naslednji način: kapilarna napetost ±3,5 kV, tlak razpršilnika 35 psi, pretok plaščnega plina 12 L/min, temperatura plaščnega plina 350 °C, temperatura sušilnega plina 250 °C in pretok sušilnega plina 14 l/min.MRM pretvorbe triptofana, piruvata, laktata, hipoksantina in ksantina so bile 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 in 151,0–107.9 oz.Podatki so bili zbrani z uporabo Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Za vzorce seruma so triptofan, piruvat, laktat, hipoksantin in ksantin kvantificirali z uporabo umeritvenih krivulj raztopin standardnih mešanic.Za celične vzorce je bila vsebnost triptofana normalizirana na notranji standard in maso celičnih beljakovin.
Ekstrakcija vrha (m/z in retencijski čas (RT)) je bila izvedena z uporabo Compound Discovery 3.1 in TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Da bi odpravili morebitne razlike med serijami, je bil vsak karakteristični vrh preskusnega vzorca deljen z karakterističnim vrhom referenčnega materiala iz iste serije, da bi dobili relativno številčnost.Relativni standardni odkloni notranjih standardov pred in po standardizaciji so prikazani v dodatni tabeli 6. Razlike med obema skupinama so bile označene s stopnjo lažnih odkritij (FDR<0,05, Wilcoxonov predznačeni rank test) in kratno spremembo (>1,2 ali <0,83).Neobdelani podatki MS ekstrahiranih značilnosti in referenčni podatki MS, popravljeni s serumom, so prikazani v dopolnilnih podatkih 1 oziroma v dopolnilnih podatkih 2.Označevanje vrhov je bilo izvedeno na podlagi štirih definiranih ravni identifikacije, vključno z identificiranimi metaboliti, domnevno označenimi spojinami, domnevno označenimi razredi spojin in neznanimi spojinami 22 .Na podlagi iskanj v bazi podatkov v Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) so bile biološke spojine z MS/MS, ki se ujemajo s potrjenimi standardi ali opombami o natančnem ujemanju v mzCloud (rezultat > 85) ali Chemspider, končno izbrane kot vmesni produkti med diferencialnim metabolomom.Opombe vrhov za vsako značilnost so vključene v dodatne podatke 3. MetaboAnalyst 5.0 je bil uporabljen za univariatno analizo številčnosti normaliziranih metabolitov.MetaboAnalyst 5.0 je ocenil tudi analizo obogatitve poti KEGG, ki temelji na bistveno različnih presnovkih.Analiza glavnih komponent (PCA) in delna diskriminantna analiza najmanjših kvadratov (PLS-DA) sta bili analizirani s programskim paketom ropls (v.1.26.4) z normalizacijo skladov in samodejnim skaliranjem.Optimalni model presnovnega biomarkerja za napovedovanje malignosti vozličkov je bil ustvarjen z binarno logistično regresijo z najmanjšim absolutnim krčenjem in izbirnim operaterjem (LASSO, paket R v.4.1-3).Delovanje diskriminantnega modela v nizih za odkrivanje in validacijo je bilo označeno z ocenjevanjem AUC na podlagi analize ROC v skladu s paketom pROC (v.1.18.0.).Optimalna verjetnostna meja je bila pridobljena na podlagi največjega Youdenovega indeksa modela (občutljivost + specifičnost – 1).Vzorci z vrednostmi, manjšimi ali višjimi od praga, bodo predvideni kot benigni noduli oziroma pljučni adenokarcinom.
Celice A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) smo gojili v mediju F-12K, ki je vseboval 10 % FBS.V lentivirusni vektor pLKO.1-puro so bile vstavljene sekvence kratke lasne RNA (shRNA), ki ciljajo na SLC7A5 in neciljno kontrolo (NC).Protismiselna zaporedja shSLC7A5 so naslednja: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Protitelesa proti SLC7A5 (#5347) in tubulinu (#2148) so bila kupljena pri Cell Signaling Technology.Protitelesa proti SLC7A5 in tubulinu so bila uporabljena v razredčitvi 1:1000 za Western blot analizo.
Glikolitični stresni test Seahorse XF meri ravni zunajcelične zakisanosti (ECAR).V testu so zaporedno dajali glukozo, oligomicin A in 2-DG, da bi testirali celično glikolitično zmogljivost, merjeno z ECAR.
Celice A549, transficirane z neciljno kontrolo (NC) in shSLC7A5 (Sh1, Sh2), smo čez noč nasadili v posode s premerom 10 cm.Celične metabolite smo ekstrahirali z 1 ml ledeno mrzlega 80% vodnega metanola.Celice v raztopini metanola smo postrgali, zbrali v novo epruveto in centrifugirali pri 15.000 × g 15 minut pri 4 °C.Zberite 800 µl supernatanta in ga posušite s hitrim vakuumskim koncentratorjem.Posušene pelete metabolita smo nato analizirali na ravni triptofana z uporabo LC-MS/MS, kot je opisano zgoraj.Celične ravni NAD(H) v celicah A549 (NC in shSLC7A5) so bile izmerjene s kvantitativnim kolorimetričnim kompletom NAD+/NADH (#K337, BioVision) v skladu z navodili proizvajalca.Za vsak vzorec so bile izmerjene ravni beljakovin, da se normalizira količina metabolitov.
Za predhodno določitev velikosti vzorca niso bile uporabljene nobene statistične metode.Prejšnje študije metabolomike, namenjene odkrivanju biomarkerjev15,18, so veljale za merila za določanje velikosti in v primerjavi s temi poročili je bil naš vzorec ustrezen.Noben vzorec ni bil izključen iz študijske kohorte.Vzorci seruma so bili naključno dodeljeni skupini za odkrivanje (306 primerov, 74,6 %) in skupini za notranjo validacijo (104 primeri, 25,4 %) za neciljane metabolomične študije.Prav tako smo naključno izbrali 70 primerov iz vsake skupine iz nabora odkritij za ciljne študije metabolomike.Raziskovalci so bili med zbiranjem in analizo podatkov LC-MS zaslepljeni za dodelitev skupin.Statistične analize metabolomičnih podatkov in celičnih poskusov so opisane v ustreznih razdelkih Rezultati, Legende slik in Metode.Kvantifikacija celičnega triptofana, NADT in glikolitične aktivnosti je bila izvedena trikrat neodvisno z enakimi rezultati.
Za več informacij o zasnovi študije si oglejte povzetek poročila o naravnem portfelju, ki je povezan s tem člankom.
Surovi podatki MS ekstrahiranih lastnosti in normalizirani podatki MS referenčnega seruma so prikazani v dodatnih podatkih 1 oziroma v dodatnih podatkih 2.Opombe vrhov za diferencialne značilnosti so predstavljene v dodatnih podatkih 3. Nabor podatkov LUAD TCGA je mogoče prenesti s spletnega mesta https://portal.gdc.cancer.gov/.Vhodni podatki za izris grafa so navedeni v izvornih podatkih.Za ta članek so navedeni izvorni podatki.
National Lung Screening Study Group itd. Zmanjšanje umrljivosti zaradi pljučnega raka z nizkoodmerno računalniško tomografijo.Severna Anglija.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR in Prophet, PC Presejanje pljučnega raka z nizkoodmernim vijačnim CT: rezultati Nacionalne presejalne študije pljuč (NLST).J. Med.Zaslon 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Zmanjšanje umrljivosti zaradi pljučnega raka z volumetričnim CT pregledom v randomiziranem preskušanju.Severna Anglija.J. Med.382, 503–513 (2020).
Čas objave: 18. september 2023